Δομική μελέτη αλληλεπιδράσεων κινασών και μικρών μορίων-αναστολέων

Abstract

The present study focuses on the implementation of various methodologies for the discovery and rational development of novel protein kinase inhibitors. Protein kinases constitute a superfamily of highly important and emerging drug targets involved in the pathology of many diseases. The subject of the study is the interaction between representative disease-relevant kinases like GSK-3β, the CDKs, the Auroras as well as DYRK1α and DYRK2 with small molecules that are potential inhibitors of those kinases. In the first part, a theoretical model of the interaction between GSK-3β and several inhibitors belonging to the indirubin scaffold is created using docking-scoring calculations. This model is utilized to gain insight to the phenomenon of inhibitor selectivity and then is used to design modifications for optimizing the inhibitors in terms of their inhibitory potency as well as their physicochemical profile. A similar model is created for the Aurora-indirubin interaction and several factors are determined that are critical for the creation of an accurate model like the presence of explicit structural water molecules. In the second part a comparative study of virtual and physical screening is presented and the evaluation of two compound collections towards the beforementioned kinases is performed. The two collections are the NCI repositoty and the collection of the NKUA School of Pharmacy. Several active compounds that can constitute novel leads for the development of highly original kinase inhibitors are recovered. Moreover, a comparison between the two methods is presented and the favourable contribution of virtual screening in the drug discovery process is discussed. The third part begins with the structural study of the interaction of DYRK2 with a selective indirubin-based inhibitor. The study is enhanced by the determination of the apoenzyme structure of DYRK2. On the basis of the crystallographic data and by the utilization of theoretical models the reproduction of the experimental structure through modeling is achieved and the structural determinants for selective DYRK inhibition are elucidated.

Η παρούσα διατριβή εστιάζει στην εφαρμογή διαφορετικών μεθοδολογιών με σκοπό την ανακάλυψη και ορθολογική ανάπτυξη νέων αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών. Οι πρωτεϊνικές κινάσες αποτελούν φαρμακολογικούς στόχους υψηλής σημασίας, οι οποίοι σχετίζονται με τη θεραπευτική ενός μεγάλου αριθμού ασθενειών. Στην παρούσα εργασία μελετάται η αλληλεπίδραση μεταξύ επιλεγμένων αντιπροσώπων της υπεροικογένειας των κινασών όπως η GSK-3β, οι CDK1, 2 και 5, οι κινάσες Aurora καθώς και οι DYRK1α και DYRK2 με μόρια τα οποία έχουν εν δυνάμει ανασταλτική δράση έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Στο πρώτο μέρος της εργασίας, μέσω υπολογισμών πρόσδεσης και αποτίμησης κατασκευάζεται ένα θεωρητικό μοντέλο της αλληλεπίδρασης μεταξύ της κινάσης GSK-3β και αναστολέων οι οποίοι ανήκουν στο μοριακό σκελετό της ιντιρουμπίνης. Το μοντέλο που προκύπτει χρησιμοποιείται αρχικά για την κατανόηση της εκλεκτικότητας των μορίων αυτών και στη συνέχεια για το σχεδιασμό νέων μορίων με βελτιστοποιημένη βιολογική δράση και φυσικοχημικές ιδιότητες. Στη συνέχεια, η κατασκευή αντίστοιχου μοντέλου για την περίπτωση των κινασών Aurora οδηγεί σε προσδιορισμό των μεθοδολογικών παραγόντων εκείνων οι οποίοι είναι κρίσιμοι για την πιστή προσομοίωση παρομοίων συστημάτων, με βασικότερο παράγοντα την παρουσία επιλεγμένων διακριτών μορίων νερού στο ενεργό κέντρο των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Στο δεύτερο μέρος παρουσιάζεται η παράλληλη εφαρμογή πειραμάτων εικονικής και φυσικής φαρμακολογικής αξιολόγησης μορίων ως υποψηφίων αναστολέων κινασών. Στη συνέχεια αποτιμώνται δύο συλλογές μικρών μορίων ως προς την ανασταλτική τους δράση έναντι των υπό μελέτη πρωτεϊνικών στόχων. Αξιολογείται η συλλογή του ιδρύματος NCI και η χημειοθήκη της Φαρμακευτικής σχολής και εντοπίζεται ένας σημαντικός αριθμός βιοδραστικών μορίων, τα οποία αποτελούν ενώσεις-οδηγούς με δυνατότητα μελλοντικής συνθετικής ανάπτυξης προς νέες κατηγορίες εκλεκτικών αναστολέων κινασών. Στο μέρος αυτό παρουσιάζεται επίσης η σύγκριση μεταξύ των δύο μεθόδων και στη συνέχεια ποσοτικοποιείται η συνεισφορά της μεθοδολογίας εικονικής αξιολόγησης στη διαδικασία ανακάλυψης νέων βιοδραστικών ενώσεων-οδηγών. Στο τρίτο μέρος παρουσιάζεται η κρυσταλλογραφική μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ της κινάσης DYRK2 και ενός εκλεκτικού αναστολέα της οικογένειας των ιντιρουμπινών. Η δομική μελέτη εμπλουτίζεται με τη δομή της DYRK2 στην αποενζυμική της μορφή. Με βάση τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα και τη συνεισφορά θεωρητικών μοντέλων προκύπτουν παρατηρήσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ της δομής του αναστολέα και της δραστικότητας προς τη συγκεκριμένη οικογένεια κινασών. Επιπλέον καθορίζονται οι κρίσιμες παραμέτροι για την πιστή αναπαραγωγή των κρυσταλλογραφικών δεδομένων μέσω θεωρητικών υπολογισμών και τέλος, η ερμηνεία των δεδομένων οδηγεί σε προτάσεις σχετικά με το σχεδιασμό νέων εκλεκτικών αναστολέων των κινασών DYRK1α και DYRK2.