Μελέτη μοριακών μηχανισμών απόκρισης του κυττάρου στις βλάβες του DNA που επάγονται από αλκυλιωτικούς παράγοντες

Abstract

Introduction: It is obvious that DNA repair plays an important role in the resistance to chemotherapeutic agents with genotoxic action. In deed, it has been previously shown that, in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of multiple myeloma (MM) patients treated with melphalan, accumulation of DNA adducts in the p53 gene correlates with better therapeutic response, and that repair in different genes correlated with the gene transcriptional activity and the degree of local chromatin condensation Purpose: One of the major subjects of my thesis is to investigate the molecular mechanistic basis of melphalan adduct repair and the relationship between the local chromatin structure, the transcriptional activity and DNA repair. The general goal of this study is to find a molecular biomarker for predicting M.M. patient response to chemotherapy with alkylating agents and its clinical application. Materials and Methods: For this purpose, we used (a) four primary human fibroblast cell lines (VH25: GGR+/TCR+; CSB: GGR+/TCR-; XPC: GGR-/TRC+; XP-A: GGR-/TCR-) with varying Nucleotide Excision Repair activity (NER) (b) the human cell line HepG2 and (c) peripheral blood mononuclear cells (PBMC) received from healthy volunteers and M.M. patients. The levels of DNA damage formation/repair induced by in vitro exposure to melphalan were measured using Southern blot analysis and the quantitative PCR assay. We focused our studies on the repair efficiency in different genomic loci corresponding to the b-actin, p53, N-ras, and d-globin genes. The steady-state RNA levels of these genes were measured by RNA slot-blot analysis whereas transcription rates were measured using a run-off transcription assay. To analyze chromatin condensation, nuclei from untreated cells were subjected to micrococcal nuclease digestion. Results: In NER–deficient cells, adducts accumulated to similar levels in all four genes indicating that the adduct formation is the same at these genomic regions. Adducts were found to be substrates for both global genome repair (GGR) and transcription-coupled repair (TCR), with TCR being less efficient than GGR. No strand-specific repair was found in GGR+/TCR+ cells, implying that in normal cells GGR dominated. The repair efficiency in different gene loci varied in a qualitatively and quantitatively similar way in both GGR-deficient and TCR-deficient backgrounds and correlated with transcriptional activity and local chromatin condensation. Additionally, adducts were lost over two sharply demarcated phases: a rapid phase resulting in the removal within 1 hour of up to ~80% of the adducts, and a subsequent phase with t1/2 36 to 48 hours. To further investigate the extensive repair occurring during the 1-hour melphalan treatment, cells were treated with a higher concentration of melphalan (100 μg/ml) for only 5 minutes and, subsequently, repair was followed for up to 2 hours. The results confirmed that, in the absence of NER, similar adduct levels accumulated in all four genes, whereas in all repair proficient backgrounds, a substantial fraction (~60–75%) of the adducts formed underwent rapid repair. To further elucidate the molecular mechanism of region specific NER, we have measured the repair efficiency and the chromatin structure, along the length of the two transcribed p53 and N-ras genes, and the silent d-globin gene, against different repair backgrounds. In NER-deficient XP-A cells, similar levels of adducts were found in all fragments examined, indicating uniform distribution of DNA damage. In both, repair-proficient CS-B and XP-C cells, faster repair was observed in regions inside the transcribed N-ras and p53 genes, compared to regions on both sides outside of the genes, while no such difference was observed for the inactive d-globin gene. Moreover, very fast adduct repair on the transcribed strand of the active genes was seen immediately downstream of the transcription start site, together with a steeply decreasing gradient of repair efficiency along the gene towards the 3′-end. In all cells analyzed, the above variation in DNA repair efficiency was paralleled exactly by the variation in the degree of local chromatin condensation, more relaxed chromatin being associated with faster repair. Similar results were obtained using peripheral blood mononuclear cells from healthy volunteers and Multiple Myeloma patients, suggesting that the existence of a repair gradient along transcribed genes may be a universal phenomenon. Interestingly, the difference in the repair activity between responders and non-responders becomes maximal at the 5′-end of the N-ras gene, decreasing towards the 3′-end of the gene. As for the d-globin gene, an induction of the transcription activity, a higher “looseness” of the local chromatin structure and an increase in the repair efficiency was observed specifically in MM patients who did not respond to melphalan therapy.Although our data showed that DNA damage induced by alkylating anticancer drugs may serve as a biomarker predictive of patient therapeutic response, the assays used for the measurement of gene specific DNA repair are fairly time-consuming, and require complex procedures such as Southern transfer and hybridization. Therefore, a more rapid and convenient methodology of wider applicability, suitable for application in a clinical context, is highly desirable. Thus, as a next step of this thesis was the development and clinical application in MM of a gene-specific, quantitative method for measuring DNA damage formation/repair following exposure to anticancer drugs inducing bulky adducts. Using the stable cell line HepG2, we found the appropriate conditions in order the extent of PCR amplification to be conversely proportional to the treatment concentrations of melphalan, implying dose-related inhibition by the DNA adducts formed. The adduct levels measured by Q-PCR were identical to the levels of interstrand cross-links (ICL) measured by Southern blot analysis, suggesting that this assay measures only melphalan-induced ICLs. Application of the Q-PCR assay to in vitro-treated human blood samples from MM patients taken prior to ASCT showed that significantly greater gene-specific damage was found in the responders group compared to non-responders [176.8+67.3 adducts/106 nucleotides (range 41.0 to 273.0) for responders and 65.1+39.4 adducts/106 nucleotides (range 22.0 to 135.0) for non-responders, p=0.002]. Conclusions: One of the major findings of this study is that in human normal cells the melphalan adducts are repaired almost exclusively by the GGR mechanism. Additionally, our study suggests that the DNA repair efficiency, the transcriptional activity and the local chromatin structure in different gene loci are tightly connected, and could be used as molecular markers to select those patients with MM who are more likely to benefit from HDM therapy. Last but not least, using the Q-PCR methodology, it is feasible to measure gene-specific damage formation/repair in a readily accessible biological material such as PBMC from humans exposed to anticancer drugs, which induce bulky adducts, and to examine, at the level of individual patient, the relationship between the induction/repair of cytotoxic DNA damage and the clinical outcome.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Είναι γενικά αποδεκτό σήμερα ότι ένας από τους βασικούς παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται η έκβαση της χημειοθεραπείας του καρκίνου με γονοτοξικά φάρμακα είναι η ικανότητα επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ικανότητα επιδιόρθωσης του γονιδίου p53 μετά από επίδραση μελφαλάνης σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με Πολλαπλούν Μυέλωμα (Π.Μ.) σχετίζεται με την κλινική απόκριση ενώ παρατηρήθηκε ότι η επιδιόρθωση του DNA σε τέσσερα γονίδια (β-ακτίνη, p53, N-ras, δ-γλοβίνη) διαφοροποιείται ανάλογα με τη μεταγραφική τους ενεργότητα και το βαθμό συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης στις συγκεκριμένες περιοχές. ΣΤΟΧΟΣ: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού επιδιόρθωσης των βλαβών που επάγονται στο DNA από αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως η μελφαλάνη καθώς και του τρόπου με τον οποίο συμβάλλει η δομή της χρωματίνης και η μεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων που μελετώνται στην επιδιόρθωση του DNA. Τελικός σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης είναι η ανεύρεση κατάλληλου μοριακού δείκτη πρόγνωσης απόκρισης ασθενών με Π.Μ. στη χημειοθεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες και η κλινική εφαρμογή του.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει (α) τέσσερις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές ανθρώπινων ινοβλαστών (VH25: GGR+/TCR+; CSB: GGR+/TCR-; XPC: GGR-/TRC+; XP-A: GGR-/TCR-) οι οποίες διαφέρουν ως προς τον επιδιορθωτικό τους μηχανισμό (β) την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 και (γ) απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με Π.Μ.. Στα κύτταρα αυτά μετά την ex vivo χορήγηση μελφαλάνης προσδιορίζονται τα επίπεδα σχηματισμού και επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA σε διαφορετικές γονιδιακές περιοχές εφαρμόζοντας ανάλυση κατά Southern και ποσοτικό PCR. Η μεταγραφική ενεργότητα των εξεταζόμενων γονιδίων προσδιορίζεται με στύπωμα κηλίδος και run off ανάλυση ενώ ο βαθμός συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης των υπό μελέτη γενωμικών περιοχών αναλύεται με την επίδραση μικροκοκκικής νουκλεάσης σε απομονωμένους πυρήνες των κυττάρων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Αρχικά μελετώνται οι κινητικές σχηματισμού και επιδιόρθωσης των βλαβών που επάγει η μελφαλάνη στις δύο αλυσίδες των παραπάνω γονιδίων μετά την επίδραση 10 μg/ml του φαρμάκου για μία ώρα στις τέσσερις κυτταρικές σειρές ινοβλαστών. Απουσία του μηχανισμού επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίου (Νucleotide Excision Repair-NER) στα κύτταρα XPA τα επίπεδα της συσσωρευμένης βλάβης είναι τα ίδια και στα τέσσερα γονίδια, υποδηλώνοντας ότι ο ρυθμός επαγωγής της βλάβης δεν διαφοροποιείται στις συγκεκριμένες περιοχές. Οι βλάβες της μελφαλάνης αποτελούν υπόστρωμα και για τους δύο υπομηχανισμούς του NER, δηλαδή τον μηχανισμό που επιδιορθώνει τις βλάβες κατά μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος (Global Genome Repair- GGR) και εκείνον που εξειδικεύεται στην επιδιόρθωση των βλαβών κατά μήκος μόνο των μεταγραφόμενων αλυσίδων του DNA των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων (Transcription Coupled Repair – TCR), με τον GGR, όμως, να επιδιορθώνει ταχύτερα του TCR. Στα φυσιολογικά κύτταρα VH25 οι κινητικές βλάβης/επιδιόρθωσης συμπίπτουν με αυτές των κυττάρων CSB, στα οποία ενεργός είναι μόνο ο GGR, υποδηλώνοντας ότι παρουσία και των δύο παραπάνω μηχανισμών ο GGR είναι αυτός που κυριαρχεί. Η επιδιορθωτική ικανότητα και των δύο μηχανισμών σχετίζεται με τα επίπεδα μεταγραφικής ενεργότητας καθώς και με τη χαλαρότητα της δομής της χρωματίνης των τεσσάρων γονιδίων που μελετάμε και ακολουθεί τη σειρά: β-ακτίνη>p53>N-ras>δ-γλοβίνη. Επίσης, οι βλάβες της μελφαλάνης επιδιορθώνονται σε δύο διακριτές φάσεις: μία αρχική ταχύτατη φάση η οποία οδηγεί στην απομάκρυνση ~80% των συνολικών βλαβών κατά τη διάρκεια της πρώτης ώρας χορήγησης του φαρμάκου η οποία ακολουθείται από μία βραδύτερη φάση στη διάρκεια της οποίας ο χρόνος ημίσειας ζωής των βλαβών είναι 36-48 ώρες. Για την περαιτέρω διερεύνηση της παρατηρούμενης αρχικής ταχύτατης φάσης επιδιόρθωσης χορηγείται στα ίδια κύτταρα υψηλή δόση μελφαλάνης (100 μg/ml) για 5 λεπτά και μετρώνται τα επίπεδα βλάβης/επιδιόρθωσης για 2 ώρες μετά το τέλος της χορήγησης. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι ενώ απουσία του NER ο ρυθμός επαγωγής της βλάβης είναι ο ίδιος και στα τέσσερα γονίδια, στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές σημαντικό ποσοστό των συνολικών βλαβών (~60-75%) επιδιορθώνονται κατά τη διάρκεια της αρχικής ταχύτατης φάσης. Ενα βασικό ερώτημα που ανακύπτει είναι εάν η ταχύτατη αυτή επιδιόρθωση είναι χαρακτηριστικό του συνολικού γονιδιώματος ή μόνο κάποιων περιοχών. Για το λόγο αυτό μελετώνται η ταχύτητα επιδιόρθωσης των βλαβών της μελφαλάνης και ο βαθμός συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης σε επιμέρους γονιδιακές περιοχές που εντοπίζονται τόσο κατά μήκος όσο και εκτός της κωδικής περιοχής των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων p53 and N-ras καθώς και του μη μεταγραφόμενου γονιδίου της δ-γλοβίνης. Η μελέτη έγινε στα κύτταρα XPA, CSB και XPC καθώς και σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς δότες και ασθενείς με Π.Μ.. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι ενώ τα επίπεδα σχηματισμού της βλάβης είναι περίπου τα ίδια σε όλες τις εξεταζόμενες περιοχές του γονιδιώματος, η ταχύτητα με την οποία επιδιορθώνουν και οι δύο υπομηχανισμοί του NER την μεταγραφόμενη αλυσίδα των γονίδιων p53 και N-ras είναι υψηλότερη εντός της κωδικής περιοχής τους σε σύγκριση με περιοχές εκτός γονιδίου. Αντίθετα, στην περίπτωση του ανενεργού γονιδίου της δ-γλοβίνης δεν παρατηρείται διαφορά στο ρυθμό επιδιόρθωσης εντός και εκτός του γονιδίου. Επιπλέον, στην περίπτωση των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων p53 και N-ras η ταχύτητα επιδιόρθωσης, παρουσία είτε του GGR είτε του TCR, εμφανίζει την υψηλότερη τιμή της στις περιοχές εντός του γονιδίου και γειτονικές με τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής ενώ μειώνεται βαθμιαία από το 5′ προς το 3′ άκρο της μεταγραφόμενης αλυσίδας του γονίδιου. Ανάλογη εικόνα προκύπτει και στην περίπτωση των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος από υγιείς δότες και ασθενείς με Π.Μ.. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις κυττάρων τα σχετικά επίπεδα συμπύκνωσης της δομής της χρωματίνης εντός και κατά μήκος των γονιδίων διαφοροποιούνται αντιστρόφως ανάλογα με τα αντίστοιχα επίπεδα επιδιορθωτικής ενεργότητας. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ασθενείς που δεν αποκρίνονται στη χημειοθεραπεία εμφανίζουν μεγαλύτερη επιδιόρθωση σε σύγκριση με εκείνους που αποκρίνονται, με τη μέγιστη διαφορά να παρατηρείται σε περιοχές κοντά στο 5′-άκρο του γονιδίου. Όσον αφορά τη δ-γλοβίνη, στα λεμφοκύτταρα των υγειών εθελοντών και των ασθενών με Π.Μ. που αποκρίνονται στη χημειοθεραπεία δεν βρέθηκε διαφορά στη ταχύτητα επιδιόρθωσης των περιοχών εντός και εκτός γονιδίου. Είναι ενδιαφέρον ότι στους μη-αποκριθέντες ασθενείς παρατηρείται μια πολύ σημαντική επαγωγή της ικανότητας επιδιόρθωσης στις περιοχές που εντοπίζονται εντός του γονιδίου της δ-γλοβίνης σε συνδυασμό με επαγωγή της μεταγραφικής ικανότητας και αύξηση της χαλαρότητας της δομής της χρωματίνης του γονιδίου. Με δεδομένη τη σημασία της επιδιόρθωσης στην πρόγνωση της ανταπόκρισης στη χημειοθεραπείας με αλκυλιωτικούς παράγοντες καθώς και το γεγονός ότι οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για τον προσδιορισμό της είναι χρονοβόρες και απαιτούν επίπονες διαδικασίες όπως η ανάλυση κατά Southern, στη συγκεκριμένη διατριβή αναπτύσσεται μεθοδολογία βασισμένη στη χρήση του ποσοτικού PCR για τη μέτρηση της βλάβης που προκαλείται από τη μελφαλάνη στο γονίδιο p53. Χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2, σε πρώτη φάση επιλέχθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες που εξασφαλίζουν την ποσοτικοποίηση των βλαβών της μελφαλάνης από την συγκεκριμένη μέθοδο. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ως μέθοδο ελέγχου την ανάλυση κατά Southern, διερευνήθηκε το είδος των βλαβών της μελφαλάνης που ανιχνεύεται από τη συγκεκριμένη μέθοδο. Έτσι, τα επίπεδα βλαβών που μετρώνται από την ποσοτική PCR ταυτίζονται με τα επίπεδα των σταυροδεσμών που ανιχνεύονται με την ανάλυση κατά Southern στα ίδια δείγματα ενώ δεν είναι δυνατή η ανίχνευση των μοναδιαίων βλαβών που επάγει το φάρμακο στο γονιδίωμα των κυττάρων. Τέλος, έγινε πιστοποίηση της μεθοδολογίας Q-PCR σε επίπεδο βιολογικών δειγμάτων (ολικό αίμα και απομονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) που ελήφθησαν από 22 ασθενείς με Π.Μ. πριν τη χορήγηση χημειοθεραπείας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι μετρούμενες βλάβες στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών που ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των ασθενών που δεν ανταποκρίθηκαν (p=0.002). Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος των βλαβών του DNA που μετρήθηκαν στους αποκριθέντες ασθενείς βρέθηκε 176.8+67.3 βλάβες/106 νουκλεοτίδια με εύρος τιμών από 41 έως 273 βλάβες/106 νουκλεοτίδια ενώ στους μη αποκριθέντες είναι 65.1+39.4 βλάβες/106 νουκλεοτίδια με το εύρος των τιμών να κυμαίνεται από 22 έως 135 βλάβες/106 νουκλεοτίδια. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ενα από τα σημαντικά ευρήματα της συγκεκριμένη διατριβής είναι ότι η επιδιόρθωση των βλαβών της μελφαλάνης σε ανθρώπινα κύτταρα πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο από τον μηχανισμό GGR. Επίσης, αποδεικνύεται η στενή αλληλεπίδραση της επιδιορθωτικής ενεργότητας με τη μεταγραφική ενεργότητα και την τοπική δομή της χρωματίνης της υπό μελέτη περιοχής, γεγονός που καθιστά και τους τρεις παραπάνω παράγοντες υποψήφιους μοριακούς δείκτες επιλογής των ασθενών με Π.Μ. που πρόκειται να ωφεληθούν από τη χορήγηση μελφαλάνης. Επιπλέον, βρέθηκαν συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος, όπως το 5΄ άκρο των μεταγραφικά ενεργών γονιδίων, στις οποίες υπάρχει στατιστικά σημαντικός συσχετισμός μεταξύ της ταχύτητας επιδιόρθωσης και της απόκρισης του ασθενούς στη χημειοθεραπεία. Τέλος, η μεθοδολογία της ποσοτικής PCR που αναπτύξαμε καθιστά δυνατή τη μέτρηση σε επίπεδο γονίδιου της επιδιόρθωσης του DNA σε εύκολα προσβάσιμο βιολογικό υλικό, όπως είναι τα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος, καθιστώντας δυνατή τη μελέτη, σε επίπεδο ασθενούς, της σχέσης του μοριακού δείκτη “επιδιόρθωση των κυτταροτοξικών βλαβών του DNA με τη κλινική απόκριση στη χημειοθεραπεία ή με τις μακροπρόθεσμες επιπλοκές της.