Ρόλος των τροποποιήσεων ιστονών και της μεθυλίωσης του TAF10 στη μεταγραφή

Abstract

Η παρούσα εργασία απαρτίζεται από δυο διακριτές ενότητες, στο πρώτο µέρος της αναγνωρίζεται ο πρώτος µεταγραφικός παράγοντας που υπόκειται σε µεθυλίωση λυσίνης από ένζυµο που ήταν γνωστό ότι ενεργοποιεί τη µεταγραφή µέσω µεθυλίωσης ιστονών, ενώ στο δεύτερο µέρος αναλύονται οι τροποποιήσεις που χαρακτηρίζουν τα ενεργά γονίδια και γίνεται µια προσπάθεια διερεύνησης της λειτουργίας τους ως «µνήµη» των κυττάρων για µαρκάρισµα των χρωµατινικών περιοχών, ανάλογα µε τη µεταγραφική ενεργότητά τους. Αναλυτικότερα: Α. Η πρώτη ενότητα περιλαµβάνει την αναγνώριση του TAF10 ως υπόστρωµα µεθυλίωσης από τη SET9. Η SET9 ήταν γνωστό ότι µεθυλιώνει την ιστόνη 3 και αυτή η τροποποίηση παρουσιάζεται σε µεταγραφικά ενεργά γονίδια, αν και οι ιστόνες που βρίσκονται πακεταρισµένες σε νουκλεοσώµατα δεν µπορούν να µεθυλιωθούν από το ένζυµο. Στην εργασία αυτή φαίνεται ότι το TAF10 µόνο-µεθυλιώνεται από τη SET9, η τροποποίηση εκείνη έχει ως αποτέλεσµα την αυξηµένη αλληλεπίδραση µε RNA πολυµεράση II και µπορεί να ενισχύσει την επαγόµενη από ορισµένους µόνο ενεργοποιητές µεταγραφή. Πειράµατα συµπληρωµατικότητας σε κύτταρα F9 στα οποία το ενδογενές γονίδιο TAF10 έχει αδρανοποιηθεί έδειξαν ότι η µεθυλίωση του παράγοντα δεν είναι απαραίτητη για τη βιωσιµότητα των κυττάρων, αλλά χρειάζεται για το µέγιστο της µεταγραφής ορισµένων µόνο εκ των γονιδίων που ρυθµίζονται από τον παράγοντα. Β. Η δεύτερη ενότητα περιλαµβάνει την ανάλυση των τροποποιήσεων ιστονών στον υποκινητή και την κωδική περιοχή τριών µεταγραφόµενων ηπατικών γονιδίων, σε κύτταρα που τα γονίδια εκείνα εκφράζονται, σε κύτταρα που έχουν σταµατήσει στη µίτωση και σε κύτταρα των οποίων η µεταγραφή έχει σταµατήσει λόγω παρουσίας α- αµανιτίνης. Η µεταγραφική ενεργοποίηση συσχετιζόταν µε εντοπισµένη ακετυλίωση ιστονών, Η3-Κ4 και Κ79 δι-µεθυλίωση και Η3-Κ4 τρι-µεθυλίωση καθώς επίσης και µε αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης στο 5΄ άκρο της κωδικής περιοχής. Η µόνο- µεθυλίωση της Η3-Κ4 παρατηρήθηκε σε τµήµατα που βρίσκονται στο µέσο της κωδικής περιοχής των γονιδίων. Οι ακετυλάσες CBP, PCAF και οι παράγοντες αναδιαµόρφωσης χρωµατίνης Brg-1, SNF2H και FACT εντοπίστηκαν στο 5΄ άκρο της κωδικής περιοχής,η ακετυλάση του συµπλόκου επιµήκυνσης της µεταγραφής Elp3, καταρροϊκά της περιοχής µε τα υπερακετυλιωµένα νουκλεοσώµατα, ενώ η 4 σύνδεση εκείνη των παραγόντων ήταν ειδική για κάθε γονίδιο. Τόσο οι ακετυλάσες όσο και οι παράγοντες αναδιαµόρφωσης χρωµατίνης και η RNA-πολυµεράση ΙΙ αποσυνδέονταν από τη χρωµατίνη κατά τη µίτωση και τη διακοπή της µεταγραφής µε α-αµανιτίνη, ενώ οι τροποποιήσεις παρέµεναν σταθερές στα κύτταρα που εκφράζονταν τα γονίδια αλλά και κατά τη διακοπή της µεταγραφής. Στα µιτωτικά κύτταρα οι τιµές των τροποποιήσεων των ιστονών παρέµεναν σταθερές στα πατρικά νουκλεοσώµατα και ξαναδηµιουργούνταν στο µέγιστο αµέσως µετά την έξοδο από τη µίτωση και την είσοδο στην επόµενη G1 φάση. Η εργασία αυτή δείχνει ότι οι τροποποιήσεις ιστονών µπορεί να λειτουργούν ως χαρακτηριστικά γνωρίσµατα της χρωµατίνης για το µαρκάρισµα των περιοχών και τη µετάδοση του µεταγραφικού δυναµικού στις επόµενες κυτταρικές γενιές. 5