Study of phenolic compounds production in spearmint (Mentha spicata L.) clones regenerated in vitro

Abstract

A protocol for efficient shoot proliferation of spearmint (Mentha spicata L.) was standardized for nodal explants when cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 1 mg/l NAA and 9 mg/l BA for high efficiency shoot proliferation within four weeks. Ten shoots from each nodal culture were obtained. Among the produced shoots, 100 explants grown in vitro for 12 weeks were transferred for four weeks into a growth regulator-free MS medium for rooting and 99% plantlets were regenerated. The effect of different strength media (full MS, ½ MS and ¼ MS) on the organogenesis of shoots and roots from nodal segments of the regenerants was also investigated. The optimum shoot proliferation and root formation was obtained in half-strength MS salts. The increase in MS basal strength was accompanied by an increase in shoot number and shoot length of grown explants. Roots were only developed in ½ strength MS and full strength MS media. The explants grown in ½ strength MS produced almost twice the number of roots with shorter length than the ones grown on full MS medium. In order to investigate the total phenolic content, RA content, total proteins content and key enzymes of the RA biosynthesis (PAL, CAH, HPPR) of shoot extracts of spearmint, 100 plantlets were regenerated from a single donor plant. Adventitious shoots were induced from nodal explants on MS medium supplemented with 1 mg/l NAA and 9 mg/l BA and rooted on a growth regulator-free medium. A considerable variation was observed in the total phenolic content in the regenerants, which was much greater than the variation in the donor plants. Moreover, the observed variation in the regenerants was much greater than the variation in the donor plants, indicating the possible effect of somaclonal variation. Total protein content assay was performed using Bearden’s Coomassie-binding colorimetric method. The activities of three enzymes involved in the RA biosynthetic pathway, phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cinnamic acid 4-hydrolase (CAH) and hydroxyphenyl pyruvate reductase (HPPR) were also determined. In addition, the antioxidant capacities in methanolic extracts of 100 regenerants compared to 10 donor plants of spearmint were investigated using different antioxidant capacity assays such as the reduction of Fe3+ to Fe2+, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH•) free radical scavenging and hydrogen peroxide scavenging activities. The average antioxidant activity in the donor plant extracts was almost double than in the regenerants. The average scavenging activity in the donor plant extracts was almost triple than in the regenerants. The average hydrogen peroxide reduction capacity of donor plants was eight times less than in the regenerants. The effect of inorganic salt concentration on the total phenolic content of spearmint by using MS medium of different strengths (full, half- and quarter strength) was examined. The highest average phenolic content was observed on shoot and root extracts cultured onto quarter and half strength medium. The strength of the nutrient medium was inversely correlated with the antioxidant activity of plant extracts.

Αναπτύχθηκε μεθοδολογία για αποτελεσματική βλαστογένεση in vitro στο δυόσμο (Mentha spicata L.) με την αλληλεπίδραση δύο φυτορυθμιστικών ουσιών. Δημιουργήθηκε πρωτόκολλο καλλιέργειας εκφύτων γονάτων βλαστών σε θρεπτικό υπόστρωμα Murashige & Skoog (MS), με προσθήκη 1 mg/l NAA και 9 mg/l BA, για μέγιστη δυνατή βλαστογένεση εντός 4 εβδομάδων. Αποκτήθηκαν 10 βλαστοί από κάθε έκφυτο γονάτου βλαστού. Από τους βλαστούς, που σχηματίστηκαν in vitro σε διάστημα 12 εβδομάδων, 100 έκφυτα μεταφέρθηκαν για ριζοβολία σε θρεπτικό υπόστρωμα MS χωρίς φυτορρυθμιστικές ουσίες και σε διάστημα 4 εβδομάδων αποκτήθηκαν έρριζα φυτάρια σε ποσοστό 99%. H επίδραση της συγκέντρωσης των ανόργανων στοιχείων του θρεπτικού υποστρώματος (πλήρες ΜS, ½ MS και ¼ MS) διερευνήθηκε στο σχηματισμό βλαστών και ριζών από τμήματα γονάτων των αναγεννημένων φυταρίων. Η βέλτιστη βλαστογένεση και δημιουργία ριζών επιτεύχθηκε στη μισή συγκέντρωση ανόργανων στοιχείων του MS. Η αύξηση στη συγκέντρωση των ανόργανων στοιχείων του MS συνοδεύτηκε με αύξηση του αριθμού και του μήκους των βλαστών που σχηματίστηκαν στα καλλιεργούμενα έκφυτα. Ρίζες εκπτύχθηκαν μόνο σε MS μισής και πλήρους συγκέντρωσης ανόργανων στοιχείων. Τα έκφυτα που καλλιεργήθηκαν σε ½ MS παρήγαγαν σχεδόν το διπλάσιο αριθμό ριζών αλλά μικρότερου μήκους σε σχέση με αυτά που βρίσκονταν σε MS πλήρους συγκέντρωσης ανόργανων στοιχείων. Προκειμένου να διερευνηθούν οι ολικές φαινολικές ουσίες, το ολικό ροσμαρινικό οξύ (ΡΟ), οι ολικές πρωτεΐνες και τα σημαντικά ένζυμα για τη βιοσύνθεση του ΡΟ (PAL, CAH, HPPR) στο εκχύλισμα βλαστών της μέντας, 100 φυτάρια δημιουργήθηκαν από ένα μόνο μητρικό φυτό δότη. Επίκτητοι βλαστοί εκπτύχθηκαν στα έκφυτα γονάτων σε θρεπτικό υπόστρωμα MS με την προσθήκη 1 mg/l NAA και 9 mg/l BA, οι οποίοι κατόπιν μεταφέρθηκαν και ριζοβόλησαν σε θρεπτικό υπόστρωμα χωρίς φυτορυθμιστικές ουσίες. Παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διακύμανση των ολικών φαινολικών ουσιών στα αναγεννημένα φυτάρια, πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τα μητρικά φυτά. Επιπρόσθετα, η διακύμανση στα αναγεννημένα φυτάρια ήταν μεγαλύτερη από ότι στα μητρικά φυτά, υποδηλώνοντας πως είναι ένα πιθανό επακόλουθο της σωματοκλωνικής παραλλακτικότητας. Η μέτρηση της ολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη έγινε χρησιμοποιώντας τη χρωμομετρική μέθοδο Bearden. Επίσης, προσδιορίστηκε η δραστικότητα των τριών ενζύμων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση του ΡΟ, δηλαδή της λυάσης της φαινυλαλανίνης (phenylalanine ammonia-lyase - PAL), της 4-υδρολάσης του κινναμικού οξέος (cinnamic acid 4-hydrolase -CAH) και της ρεδουκτάσης του υδροξυφαινυλοπυρουβικού οξέος (hydroxyphenyl pyruvate reductase - HPPR). Επιπλέον, η αντιοξειδωτική ικανότητα των εκχυλισμάτων φαινολικών από τα 100 αναγεννημένα φυτάρια συγκρίθηκε με αυτή των 10 μητρικών φυτών, με τη χρήση διαφορετικών μεθόδων, όπως η αναγωγή Fe3+ σε Fe2+, η ικανότητα εξουδετέρωσης (free radical scavenging) του ελεύθερου ριζικού 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλ-υδραζίδιου (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl - DPPH•) και του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ο μέσος όρος της αντιοξειδωτικής δράσης στα εκχυλίσματα των μητρικών φυτών ήταν σχεδόν διπλάσιος από ότι ήταν στα αναγεννημένα φυτάρια. Ο μέσος όρος της αντιοξειδωτικής ικανότητας στα εκχυλίσματα των μητρικών φυτών ήταν σχεδόν τριπλάσιος από ότι ήταν στα αναγεννημένα φυτάρια. Ο μέσος όρος της ικανότητας αναγωγής του υπεροξειδίου του υδρογόνου για τα μητρικά φυτά ήταν οκτώ φορές λιγότερο από ότι ήταν στα αναγεννημένα φυτάρια. Παράλληλα, διερευνήθηκε η επίδραση που έχει η συγκέντρωση των ανόργανων στοιχείων του θρεπτικού υποστρώματος MS (πλήρης, μισή και ένα τέταρτο συγκέντρωση) στην περιεκτικότητα των ολικών φαινολικών ουσιών στη μέντα. Η υψηλότερη περιεκτικότητα φαινολικών ουσιών μετρήθηκε στα εκχυλίσματα βλαστών και ριζών που προήλθαν από καλλιέργεια σε θρεπτικά υποστρώματα με ένα τέταρτο και μισή συγκέντρωση ανόργανων στοιχείων, αντίστοιχα. Η συγκέντρωση των ανόργανων στοιχείων του θρεπτικού υποστρώματος είχε αντιστρόφως ανάλογη συσχέτιση με την αντιοξειδωτική ικανότητα των φυτικών εκχυλισμάτων.