Διερεύνηση των μηχανισμών σηματοδότησης της θυρεοειδικής ορμόνης στην καρδιά

Abstract

Besides the well characterized genomic action of thyroid hormone, mediated by its nuclear receptors (TRs), accumulating data support the so called non-genomic action of T3, which is often related to activation of signalling pathways. The aim of the present study was to investigate T3 action on intracellular signalling pathways and on the remodeling of the heart. In order to achieve this goal we used adult cardiac myocytes. Initially, we investigated the activation of signalling pathways by T3. Our results demonstrate that T3 promotes a rapid increase in the phosphorylation of kinases ERK1/2, p38-MAPK, Akt and PKCδ within 5-20 minutes. This activation is inhibited by triiodothyroacetic acid (triac) a T3 analogue known to displace the hormone from membrane bound receptors, indicating that this T3 effect is mediated through a cell membrane initiated mechanism. In addition, we investigated the activation of signaling pathways in H9c2 cells. T3 administration resulted in a rapid phosphorylation of ERK1/2, Akt and PKCα/β in these cells. We further investigated a possible interaction of T3 genomic and non-genomic action. Cardiomyocytes were incubated with specific inhibitors of the T3-activated kinases. The pharmacological inhibition of the these kinases showed that the long-term effects of T3 on sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) upregulation, α- and β- myosin heavy chain (MHC) gene and protein expression are reverted. These results imply that what is initiated as a non-genomic action of the hormone interfaces with genomic effects and could modulate the expression of target proteins important in cardiac function. Although T3 downregulates the expression of phospholamban (PLB) mRNA, an increase in PLB pentamer protein expression was observed. We show that this increase is due to increased phosphorylation of PLB monomers that lead to increased pentamer formation. From the above we conclude that signal transduction pathways mediate expression of T3-target genes, both on transcriptional and post-transcriptional level. It is well established that T3 has prominent effects on cardiac physiology that could result in compensatory chamber remodeling. We investigated whether T3 can induce hypertrophy directly in cultured cardiac myocytes. The results indicated that T3 induced physiological growth as evidenced by the increased cell size and the unaltered ANP expression, a well known marker of pathological hypertrophy. Inhibition of the T3-activated kinases reversed the effect on cell growth implying the involvement of signalling pathways in this process. We also investigated the action of T3 on the shape of cardiac cells that undergo pathological hypertrophy. T3 changed the shape of these cardiac cells indicating that T3 could reverse pathological hypertrophy to a normal cardiac configuration. We further investigated the effect of DEA and DBD on the transcriptional activity of thyroid hormone receptors, TRα1 and TRβ1. The transcriptional activity of the TRα1 receptor seemed to be specifically decreased by DBD. This inhibitor could be used as a potential therapeutic agent for manipulating T3 actions in the physiology of both heart and the whole organism. In summary, the results of the present study provide insights into the mechanisms of T3 action in adult cardiac myocytes. These can be further used to investigate the pathophysiology of the heart.

Εκτός από την καλά χαρακτηρισμένη γενωμική δράση των θυρεοειδικών ορμονών πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν τη μη-γενωμική τους δράση, η οποία σχετίζεται κυρίως με την ενεργοποίηση σηματοδοτικών οδών. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών σηματοδότησης της Τ3 στην καρδιά. Ως πειραματικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκαν απομονωμένα καρδιομυοκύτταρα ενήλικου επίμυ. Αρχικά, διερευνήθηκε η ενεργοποίηση, από την Τ3, σηματοδοτικών κινασών. Καρδιακά κύτταρα επωάστηκαν παρουσία Τ3 και ακολούθησε ανοσοανίχνευση των φωσφορυλιωμένων μορφών των κινασών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Τ3 επάγει την φωσφορυλίωση των ERK1/2, p38-MAPK, Akt και PKCδ. Η χρήση του θυρεοειδικού αναλόγου triac, αναστολέα της πρόσδεσης της Τ3 σε μεμβρανικούς υποδοχείς, ανέστειλε την Τ3-επαγόμενη ενεργοποίηση κινασών, υποδεικνύοντας ότι αυτή η δράση της Τ3 διαμεσολαβείται από ένα μηχανισμό με σημείο έναρξης την κυτταρική μεμβράνη. Ακολούθως, διερευνήθηκε η συμμετοχή των παραπάνω κινασών στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων-στόχων της Τ3 στα καρδιομυοκύτταρα, όπως η Ca-ATΡαση του σαρκοπλασματικού δικτύου (SERCA2α), οι α- και β- ισομορφές της βαρειάς αλυσίδας της μυοσίνης (MHC) και η φωσφολαμβάνη (PLB). Για αυτό καρδιομυοκύτταρα επωάστηκαν με Τ3 απουσία ή παρουσία ειδικών αναστολέων για τις κινάσες. Η χρήση των αναστολέων οδήγησε σε αντιστροφή της επίδρασης της Τ3 στη μεταγραφή των γονιδίων αυτών. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι στην περίπτωση του PLB, ενώ η Τ3 ρυθμίζει αρνητικά τη μεταγραφή του γονιδίου, οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση των πενταμερών της πρωτεΐνης. Δεδομένου ότι το αποτέλεσμα αυτό δεν ήταν αναμενόμενο, διερευνήθηκε περαιτέρω. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Τ3 επάγει τη φωσφορυλίωση της PLB και οδηγεί σε αυξημένη δημιουργία του πενταμερούς της. Ένα γενικότερο συμπέρασμα που προκύπτει από τα παραπάνω είναι ότι μηχανισμοί σηματοδότησης μπορούν να συμμετέχουν στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων-στόχων της Τ3, τόσο σε μεταγραφικό, όσο και σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Η Τ3 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη προσαρμοστική διαδικασία της αναδιαμόρφωσης της καρδιάς και για αυτό διερευνήθηκε ο ρόλος της στη μεταβολή της μορφολογίας των καρδιομυοκυττάρων κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή μετά από επαγωγή παθολογικής υπερτροφίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Τ3 επάγει φυσιολογική υπερτροφία με αύξηση της κυτταρικής επιφάνειας χωρίς μεταβολή των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου ΑΝΡ που αποτελεί δείκτη παθολογικής υπερτροφίας. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η συμμετοχή των σηματοδοτικών οδών που χαρακτηρίζουν τη μη-γενωμική δράση της Τ3. Παρατηρήθηκε ότι η αναστολή των κινασών ανέστρεψε την Τ3-επαγόμενη κυτταρική αύξηση υποστηρίζοντας τον ρόλο των σηματοδοτικών οδών στη διαδικασία αυτή. Η παρουσία της Τ3 προκάλεσε αλλαγές στο σχήμα των καρδιακών μυοκυττάρων στα οποία είχε προκληθεί παθολογική υπερτροφία με χορήγηση φαινυλεφρίνης, που αποτελεί γνωστό υπερτροφικό παράγοντα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η Τ3 μπορεί να έχει θετική επίδραση αντιστρέφοντας τη διαδικασία της αναδιαμόρφωσης της καρδιάς. Τέλος, ελέγχθηκε η επίδραση των ενώσεων DEA και DBD στη μεταγραφική ενεργότητα των θυρεοειδικών υποδοχέων TRα1 και TRβ1. Κύτταρα CV-1 διαμολύνθηκαν με τον TRα1 ή TRβ1 και το γονίδιο αναφοράς DR4-CAT. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν σε Τ3 ή/και στις δύο ενώσεις. Η μεταγραφική ενεργότητα του TRα1 υποδοχέα ήταν μειωμένη παρουσία της DBD, οπότε δίνεται η δυνατότητα χρήσης του για τη φαρμακολογική διαχείριση επιδράσεων της Τ3 στη φυσιολογία τόσο της καρδιάς, όσο και ολόκληρου του οργανισμού. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας παρέχουν πληροφορίες για το ρόλο και τον μηχανισμό δράσης της Τ3 σε καρδιακά μυοκύτταρα, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη διερεύνηση και αντιμετώπιση παθολογικών καταστάσεων της καρδιάς.