Μελέτη του βιολογικού κύκλου του ιοειδούς Potato spindle tuber viroid σε φυτά Nicotiana benthamiana που είναι κατεσταλμένα για τις πρωτεΐνες τύπου Dicer

Abstract

RNA silencing is a wide spead mechanism that negatively regulates gene expression. It is involved in different developmental phenomena in higher eukaryotes like cancerogenesis in mammals and defense against viruses and transposable elements in plant kingdom. By now many different RNA silencing pathways are identified. Key players of the mechanism are the small RNAs (21-24 nuceotides long), that are produced by RNAseIII Dicer-like proteins (DCLs). The role of small RNAs is governed by the DCL that generated it. Each DCL produces a distinct size of small RNA, which target homologous RNA and DNA sequences for degradation or methylation, respectively. Viroids are minimal pathogens that infect plants systemically and locally. Their gemone consists of a single stranded, naked RNA molecule that does not code for any protein. Viroids, or their double stranded RNA intermediates are substrate for DCLs. The produced small RNAs are biologically active in trans, but most probably not in cis, since viroids infectivity and titer are not reduced. The aim of this thesis is to understand i) how RNA silencing machinery influences the biological cycle of Potato tuber spindle tuber viroid (PSTVd) and ii) how PSTVd influences RNA silencing pathways. Previous studies in our laboratory identified DCL fragments from the non sequenced organisms Nicotiana benthamiana and Lycopersicon esculentum. These enzymes are both functionally and structurally conserved in eukaryotes. The isolated DCL fragments were used for the production of constucts that suppress DCLs expression in both organisms. In this work, we produced N. benthamiana plants, which are knocked down for the four plant Dicer-like proteins. These plants were used for monitoring the infectivity of PSTVd. In more detail, i) we investigated the role of each DCL in PSTVd processing, ii) we performed time course analysis of PSTVd infection in whole plant level and iii) we analyzed PSTVd replication in cellular level. Our results indicate that DCL2, DCL3 and DCL4 process PSTVd, since we could detect 22- , 24- and 21 nt small RNAs, respectively. In addition, the detection of plus and minus polarity small RNAs suggest that double stranded PSTVd molecules are substrate for the above DCLs. The role of DCL1 on PSTVd processing was elusive. Our results for PSTVd infectivity in whole plant analysis suggest an active role for DCL1 and DCL4. This was not observed in cellular level, though. We conclude that DCL1 and DCL4 are essential, at least at the first stages of viroid´s systemic spread, indicating an unexpected auxilliary role of RNA silencing on PSTVd infection. Finally, we have shown that PSTVd does not revert already established virus induced gene silencing, but it delays its establishment. Overall, we hypothesize that although PSTVd is targeted by RNA silencing it has evolved to use the latter to its benefit.

Η RNA σίγηση είναι ένας ευρύτατα διαδεδομένος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Εμπλέκεται σε διάφορα αναπτυξιακά φαινόμενα σε όλους τους ευκαρυώτες, την καρκινογένεση στα θηλαστικά, ενώ μία από τις βασικότερες λειτουργίες του μηχανισμού στους φυτικούς οργανισμούς είναι αυτή της άμυνας ενάντια σε ιούς και μεταθετά στοιχεία. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί διάφορα μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται ο μηχανισμός, με κύριο χαρακτηριστικό όλων την παραγωγή μικρών RNAs της τάξης των 21-24 νουκλεοτιδίων που αποτελούν τους κύριους τελεστές του μηχανισμού. Υπέυθυνα ένζυμα για την παραγωγή αυτών των RNAs είναι οι πρωτεΐνες τύπου Dicer (Dicer-like proteins, DCLs). Ρόλος των μικρών RNAs, ο οποίος ορίζεται από το μέγεθος τους και την DCL από την οποία παρήχθησαν, είναι η στόχευση ομόλογων DNA και RNA αλληλουχιών προς μεθυλίωση ή αποικοδόμηση αντίστοιχα. Τα ιοειδή αποτελούν τα απλούστερα φυτικά παθογόνα με ικανότητα τοπικής και διασυστηματικής μόλυνσης. Το γονιδίωμα τους αποτελείται από ένα μονόκλωνο μόριο RNA, άνευ περιβλήματος που δεν κωδικοποιεί καμία πρωτεΐνη. Το ιοειδές, ή και τα ενδιάμεσα δίκλωνα μόρια του πολλαπλασιασμού του φαίνεται ότι αποτελεί υπόστρωμα για τις DCLs. Τα μικρά RNAs που παράγονται είναι βιολογικά ενεργά in trans, αλλά κατά πάσα πιθανότητα όχι in cis, καθώς το ιοειδές διατηρεί την ικανότητα μόλυνσης, χωρίς να φαίνεται να επηρεάζεται ο τίτλος του. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η επίδραση της RNA σίγησης στη μολυσματικότητα του ιοειδούς Potato Spindle tuber Viroid (PSTVd), όπως και η επίδραση που έχει το PSTVd σε χαρακτηρισμένα μονοπάτια της RNA σίγησης. Προηγούμενη μελέτη στο εργαστήριο είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση και κλωνοποίηση τμημάτων των πρωτεϊνών DCL από τους μη αλληλουχημένους οργανισμούς Nicotiana benthamiana και Lycopersicon esculentum. Τα ένζυμα αυτά είναι λειτουργικά και δομικά συντηρημένα σε μεγάλο βαθμό στους ευκαρυώτες. Τα απομονωμένα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή κατασκευών, οι οποίες μέσω RNA σίγησης οδηγούν στην καταστολή των DCLs στους παραπάνω οργανισμούς. Στην εργασία αυτή, προχωρήσαμε στην παραγωγή διαγονιδιακών φυτών N. benthamiana που είναι κατεσταλμένα για τις DCLs και τα φυτά αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως εργαλεία στη μελέτη του βιολογικού κύκλου του PSTVd. Συγκεκριμένα, αναλύθηκε η επίδραση όλων των DCLs i) στην επεξεργασία του ιοειδούς ή/και των δίκλωνων μορφών του ii) στη διασυστηματική ικανότητα μόλυνσης του ιοειδούς συναρτήσει χρόνου και iii) στον πολλαπλασιασμό του σε κυτταρικό επίπεδο. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν πως οι DCL2, DCL3 και DCL4 πέπτουν το ιοειδές προς μικρά RNA μόρια, 22-, 24- και 21 ντ αντιστοίχως. Το γεγονός ότι ανιχνεύσαμε μικρά RNA μόρια θετικής και αρνητικής πολικότητας υποδηλώνει ότι τα ενδιάμεσα μόρια του πολλαπλασιασμού του είναι υπόστρωμα για αυτές τις DCLs. Ο ρόλος της DCL1 ως προς την επεξεργασία του ιοειδούς δεν υπήρξε ξεκάθαρος. Τα αποτελέσματά μας σε διασυστηματικό επίπεδο έδειξαν ενεργό ρόλο της DCL1 και DCL4, κάτι που δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρικό επίπεδο. Το αξιοσημείωτο είναι πως το PSTVd μάλλον χρειάζεται, τουλάχιστον στα πρώτα στάδια διασυστηματικής μόλυνσης, την επεξεργασία του από τις DCLs αυτές. Οι αναλύσεις μας υποδεικνύουν ένα πιθανό επικουρικό ρόλο της RNA σίγησης στη μόλυνση του PSTVd, κάτι που αντιβαίνει στον έως τώρα γνωστό ρόλο άμυνας της RNA σίγησης. Τέλος, δείξαμε πως το PSTVd μπορεί να καθυστερήσει την εμφάνιση μη εδραιωμένης ιικά επαγώμενης RNA σίγησης, αλλά δεν επηρεάζει την εκδήλωση ήδη εδραιωμένης ιικά επαγώμενης RNA σίγησης, υποδεικνύοντας έτσι ότι δε λειτουργεί ως καταστολέας της RNA σίγησης. Από τα παραπάνω καταλήγουμε πως τα ιοειδή, ενώ στοχεύονται από την RNA σίγηση, έχουν εξελιχθεί ώστε να χρησιμοποιούν και στοιχεία του μηχανισμού αυτού προς όφελός τους.