Μελέτη της έκφρασης, της ρύθμισης και του βιολογικού ρόλου του crh και των defensins στο αναπαραγωγικό σύστημα της γυναίκας

Abstract

CRH is a very important regulator of stress in mammals. Although initially reported to beexpressed in the CNS where it inhibits the inflammatory reaction, several studies haveshown that CRH is as well expressed in several peripheral tissues mediating the stresseffect and stimulating local inflammation. CRH is involved in human pathophysiologysince pathogenesis is considered a disturbance of homeostasis, and therefore a stresscondition. Based on these data, carcinogenesis and tumor progression were expected tobe related to CRH. Despite the fact that CRH expression has been described in severalgynecological cancers (breast, ovarian, and endometrial carcinomas), CRH expressionwas never studied in cervical cancer cells.Human beta-defensins (HBDs) are small natural secreted antimicrobial and antiviralpeptides, having direct anti-microbial, anti-fungal, anti-viral activity and main role ininitiation, spread and regulation of the immune-inflammatory responses. Act locally askey regulators of the influenced innate immune system, attracting iDCs and increasingtheir numbers, trying to prevent and viral infections. HBDs considered to affect theinitiation of innate immunity, but there is evidence that they perform an important rolein the development of adoptive immunity. They are expressed in the epithelial cells ofthe female reproductive system and to various tissues of the reproductive system, suchus endometrium, placenta, and in situations of ovarian malignancy. HBD1 is constantlyproduced in various tissues epithelial cells, while HBD2 expression, in contrast, ismediated by inflammation and it is known for its antimicrobials and anti-viral activityand that is contributes to the production or induction of anti-inflammatory mediators.Although specific anti-inflammatory peptides are sufficiently studied, no evidence fortheir expression and their role in the initiation and progression of cancer of the cervixexists. This doctoral thesis focused on the study of the expression of CRH, HBD1, HBD2peptides in Cervical Intraepithelial Neoplasia (CIN) and squamous cell carcinoma of thecervix. Their expression was also studied in vitro, using HeLa cell line.The study was also extended to other neuropeptides, such as UCN, CRH-R1 and CRH-R2,in HeLa, in vitro. An additional purpose of this research was the effect of CRH in the proapoptotic FasL, in conditions of cervical cancer In vitro. FasL was recently found to beexpressed in cervical cancer, while the system CRH-Fas/FasL exist in malignant ovarianconditions. It was found that human cervical cancer HeLa line, expresses CRH. The factthat FasL expression, has been shown to induce apoptosis of T lymphocytes, thusfacilitating the immune escape of cancer, highlights the contribution of FasL in cervicalcarcinogenesis and development.HeLa cell line was proved to express FasL. Interestingly, for the first time wasdemonstrated in vitro, in HeLa, that FasL expression was induced through CRH. Theabove findings, potential are the first significant points that the immune escape oftumor cells in the cervix, may be associated with stress. But it is necessary to conductfurther experiments to confirm these findings and in vivo.The existence of receptors CRH (CRH-R1, CRH-R2) have been confirmed in reproductivetissues such as the ovaries, endometrium, myometrium and placenta. Recently, a studyof our laboratory confirmed the co-expression of CRH, FasL and CRH-R1 peptides inovarian cancer. The findings of this thesis, suggesting that the CRH-induced FasL isthrough receptor CRH-R1. The pharmacological blockade of CRH-R1 was withantalarmin. Furthermore, we assume that both the expression of CRH and FasL may beassociated with HPV infection. Additional findings of this thesis is the expression of UCNin HeLa In vitro. Furthermore, expression of CRH-R2 receptor proved in vitro. Thesefindings are in conjunction with previous studies; suggest that CRH modulates localimmune escape. Further studies are needed to clarify the mechanism of CRH expressionand its action towards being the single/main FasL inducer or not. If CRH was proven asthe sole or the main FasL inducer, anti-CRH interventions would be an option to blockthe immuno-escape mechanisms, allowing local T cells to restrict tumor growth andprogression. In this thesis, was found HBD1 and HBD2 expression in HeLa, cell line, invitro and in CIN1,2,3 and SCC. The defensins have potential cytotoxic effect to tumorcells and may be able to contribute to the recovery of immune capacity differentiatesthe progression of cervical carcinogenesis and this gives additional growth potential newanti-cancer approach.

Ο CRH είναι αρκετά σημαντικός ρυθμιστής στρες στα θηλαστικά. Αν και αρχικά έχειαναφερθεί ότι εκφράζεται στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, όπου και αναστέλλει τηνφλεγμονώδη αντίδραση, αρκετές μελέτες δείχνουν ότι ο CRH εκφράζεται εξίσου σεαρκετούς περιφερικούς ιστούς ρυθμίζοντας την επίδραση στο στρες και επάγονταςτοπικά φλεγμονή. Ο CRH συμμετέχει στην ανθρώπινη φυσιολογία, από την στιγμή πουη παθογένεση θεωρείται διαταραχή της ομοιόστασης, άρα και συνθήκη στρες.Βασιζόμενοι σε αυτά τα στοιχεία, η καρκινογένεση και η εξέλιξη του όγκου αναμενόταννα συσχετιστούν με τον CRH. Παρά το γεγονός όμως ότι η έκφραση του CRH έχειπεριγραφεί σε αρκετούς γυναικολογικούς καρκίνους (μαστούς, ωοθήκες, ενδομητριακόκαρκίνωμα, παρόλα αυτά η έκφραση και ο ρόλος της στον καρκίνο του τραχήλου τηςμήτρας παραμένει αδιευκρίνιστος.Οι Ανθρώπινες β-Ντιφενσίνες (HBDs), είναι φυσικά αντιμικροβιακά πεπτίδια, με άμεσηαντιμικροβιακή, αντι-μυκητιακή και αντι-ιική δράση και έχουν κεντρικό ρόλο στηνέναρξη, διάδοση και ρύθμιση της ανοσο-φλεγμωνώδης απόκρισης. Δρουν τοπικά ωςβασικοί ρυθμιστές του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, το επηρρεάζουν,προσελκύοντας iDCs και αυξάνοντας τον αριθμό τους, προσπαθώντας να αποτρέψουνμολύνσεις και από ιούς. Θεωρείται ότι επιδρούν και στην έναρξη της έμφυτης ανοσίας,όμως υπάρχουν στοιχεία που τους αποδίδουν σημαντικό ρόλο και στην ανάπτυξη τηςαναπτυσσόμενης ανοσίας. Εκφράζονται τόσο στα επιθηλιακά κύτταρα του γυναικείουαναπαραγωγικού συστήματος, όσο και σε διάφορους ιστούς του αναπαραγωγικού μαςσυστήματος, το ενδομήτριο, τον πλακούντα και σε καταστάσεις κακοήθειας στιςωοθήκες. Η HBD1 παράγεται διαρκώς στα επιθηλιακά κύτταρα διαφόρων ιστών, ενώστην HBD2 αντίθετα, η έκφραση προκαλείται από φλεγμονή και είναι γνωστή για τηναντιμικροβιοκτόνα και αντι-ιική δράση της και στο ότι συμβάλλει στην παραγωγή ήεπαγωγή αντι-φλεγμονωδών μεσολαβητών. Αν και τα συγκεκριμένα αντι-φλεγμονώδηπεπτίδια είναι αρκετά μελετημένα, δεν υπάρχουν στοιχεία για την έκφραση και τονρόλο τους κατά την έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην μελέτη της έκφρασης των πεπτιδίωνCRH, HBD1 και HBD2 στα ενδιάμεσα στάδια Τραχηλικής Ενδοεπιθηλιακής Νεοπλασίας(CIN, Cervical Intraepithelial Neoplasias) και στο πλακώδες καρκίνωμα στον τράχηλο τηςμήτρας, καθώς και στο in vitro σύστημα μελέτης του πλακώδους επιθηλίου τουκαρκίνου του τραχήλου, τα HeLa.Η μελέτη στη συνέχεια επεκτάθηκε και σε συγγενή πρωτεϊνικά μόρια της οικογένειαςτων νευροπεπτιδίων, την UCN και τους υποδοχείς CRH-R1 και CRH-R2, in vitro, σταHeLa. Επιπλέον σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η επίδρασητου CRH στον προαποπτωτικό FasL σε συνθήκες διηθητικού καρκίνου In vitro, διότιπρόσφατα εντοπίσθηκε να εκφράζεται στον καρκίνο του τραχήλου, ενώ το σύστημαδράσης CRH-Fas/FasL υπάρχει σε συνθήκες κακοήθειας των ωοθηκών.Διαπιστώθηκε ότι η ανθρώπινη καρκινική τραχηλική σειρά HeLa εκφράζει τον CRH. Τογεγονός ότι η έκφραση του FasL, έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί την απόπτωση των Τ-λεμφοκυττάρων, άρα διευκολύνει την ανοσο-διαφυγή του καρκίνου προβάλει τηνσυμβολή του FasL στην τραχηλική καρκινογένεση και εξέλιξη. H κυτταρική σειρά HeLaαποδείχθηκε να εκφράζει και τον FasL. Είναι ενδιαφέρον επίσης, το ότι για πρώτη φοράαποδεικνύεται στο in vitro μοντέλο μελέτης του καρκίνου του τραχήλου, τα HeLa, ότι ηέκφραση του FasL ρυθμίζεται διαμέσω του CRH. Το παραπάνω εύρημα πιθανών νααποτελεί το πρώτο σημαντικό στοιχείο ότι η ανοσο-διαφυγή των καρκινικών κυττάρωνστον τράχηλο, μπορεί να συνδεθεί με το στρες. Είναι αναγκαίο όμως να διεξαχθούνπεραιτέρω πειράματα με σκοπό την επιβεβαίωση αυτών των συμπερασμάτων και invivo.Η ύπαρξη των υποδοχέων του CRH (CRH-R1, CRH-R2) έχει επιβεβαιωθεί σεαναπαραγωγικούς ιστούς, όπως τις ωοθήκες, το ενδομήτριο και το μυομήτριο, καθώςκαι τον πλακούντα. Πρόσφατα, σε μελέτη του εργαστηρίου επιβεβαιώθηκε ηταυτόχρονη έκφραση των πεπτιδίων CRH, FasL και CRH-R1 στον καρκίνο των ωοθηκών,εύρημα που υποδηλώνει ότι η CRH επαγωγή του FasL γίνεται διαμέσω του υποδοχέαCRH-R1. Στην συγκεκριμένη διατριβή, επιβεβαιώθηκε στο In vitro σύστημα των HeLa,ότι η CRH επαγωγή του FasL γίνεται διαμέσω του υποδοχέα CRH-R1. Ο φαρμακολογικόςαποκλεισμός του CRH-R1 έγινε με τη χρήση ανταλαρμίνης. Επιπλέον, υποθέτουμε ότιτόσο η έκφραση του CRH όσο και του FasL μπορεί να συσχετίζεται με την μόλυνση από τον ιο HPV. Συμπληρωματικό εύρημα στην παρούσα διατριβή αποτελεί και η έκφρασητης UCN στο In vitro σύστημα, τα HeLa. Επιπλέον, η έκφραση του υποδοχέα CRH-R2αποδείχτηκε in vitro.Τα συγκεκριμένα ευρήματα σε συνάρτηση με προηγούμενες μελέτες, υποστηρίζουν ότιο CRH διαμορφώνει δράση τοπικής ανοσο-διαφυγής. Επιπλέον μελέτες είναι αναγκαίεςόμως με σκοπό να διευκρινιστεί αν ο CRH είναι μοναδικός ή βασικός επαγωγέας τουFasL, με σκοπό να επιβεβαιωθεί μία αντι-CRH προσέγγιση ενάντια στον καρκίνο τουτραχήλου της μήτρας.Στη συγκεκριμένη διατριβή, βρέθηκε σε πειράματα επί ιστών και στην ανθρώπινηκαρκινική σειρά τραχήλου της μήτρας, τα HeLa, να εκφράζεται η HBD1 και η HBD2. ΟιΝτιφενσίνες πιθανών να έχουν κυτταροτοξική επίδραση προς τα καρκινικά κύτταρα καιίσως να μπορούν να συμβάλλουν στην ανάκτηση της ανοσο-ικανότητας πουδιαφοροποιεί την εξέλιξη της τραχηλικής καρκινογένεσης και αυτό δίδει νέεςπροοπτικές ανάπτυξης πιθανών νέας αντι-καρκινικής προσέγγισης.