Νησίδες πλασμιδιακής αντοχής στα αντιβιοτικά: μελέτη δομής, έκφρασης και μετακίνησης συγκροτημάτων γονιδίων αντοχής σε κλινικά στελέχη εντεροβακτηριοειδών

Abstract

Emergence and spread of clinical enterobacterial strains exhibiting resistance to multiple antibiotic classes (Multi-Drug Resistant [MDR] strains) is considered as a serious public health problem of global dimensions. The MDR phenotype observed in a given clinical strain is primarily due to the acquisition of plasmids carrying a wide variety of resistance genes of diverse origin (MDR plasmids) along with multiple copies of mobile genetic elements such as transposons, insertion sequences and integrons, commonly of class 1. In addition, MDR plasmids, more often than not, maintain their conjugal properties i.e. the capability for self-transferring among bacterial cells that may belong to the same or different species. This transferability enhances the potential for spread of plasmid-carried resistance genes especially in the selective hospital environment. The aims of the present study were to gain insights on the mechanisms i) of formation of MDR plasmids and ii) of the regulation of expression of the plasmid-borne resistance genes focusing on those carried by the variable regions of class 1 integrons. For these purposes, the whole nucleotide sequences of two distinct enterobacterial plasmids, namely p3521 and pNL194 conferring MDR phenotypes to their hosts, were determined and analyzed. In addition, an experimental approach, mainly based on site-specific mutagenesis and RT-PCR was devised in order to quantify transcription of resistance genes carried by integrons under controlled experimental conditions. The nucleotide sequences of the MDR plasmids p3521 (110.416 bp) and pNL194 (79.307 bp) revealed that they shared a common structural characteristic: both comprised two contiguous segments, a plasmidic one including, among others, all the genes indispensable for replication and maintenance and an acquired sequence resembling a mosaic of mobile elements, resistance genes and fragments of diverse chromosomal origin. This organization pattern, although indicates multiple sequential events of acquisition of exogenous DNA, excludes the possibility that these events occur at random plasmid sequences. A sound evolutionary hypothesis is that a region in a dispensable sequence of the plasmid backbone was initially attacked by a mobile element, be it a transposon or an insertion sequence. Due to the properties of the latter sequences, especially those of the flanking parts, this event most likely created a segment prone to acquire additional mobile elements carrying various resistance genes. Sequence analysis also indicated extensive re-arrangements within the acquired segment that do not allow for a reliable reconstruction of the whole series of events. The final result, nevertheless, is an evolving and, at least partly, mobile mosaic MDR sequence (multi-resistant island). During the course of determining the plasmid sequence of p3521, two novel bla genes, designated blaSCO-1 and blaACC-4 were identified. Hydrolysis experiments and isoelectric focusing documented production of the respective β-lactamases, SCO-1 and ACC-4. Characterization of the two new types of β-lactamases showed that SCO-1 was phylogenetically associated with the RTG subgroup of CARB enzymes, and is the first plasmid encoded enzyme belonging to this group. The blaSCO-1 gene is probably of chromosomal source. The ACC-4 β-lactamase is a member of the plasmid encoded cephalosporinases derived from Hafnia alvei differing from ACC-1, the prototype enzyme of this group, by a substitution of Val-for-Gly211. This single change caused a significant raise in the hydrolytic efficiency against extended-spectrum cephalosporins. The increased hydrolysis rate of ACC-4 against cephalosporins is possibly due to a wider active site. Experiments studying the expression of gene cassettes in class 1 integrons showed wide differences in the strengths of promoter sequences that had not been studied before. Hybrid 2 version of Pc is an effective promoter stronger than hybrid 1, and the active configuration of P2 results in an additive effect on promoter strength to any type of Pc. Interestingly, it was documented that the presence of small ORFs, overlapping the attI1 site, indirectly enhanced translation of the proteins encoded by the downstream gene cassettes. It can be hypothesized that the SD sequences of the small ORFs protect the mRNA molecules from degradation ensuring therefore expression of resistance genes.

Το φαινόμενο της πολλαπλής αντοχής των παθογόνων βακτηρίων είναι ένα από τα σημαντικά θεραπευτικά προβλήματα στη σύγχρονη κλινική πράξη. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στην οργάνωση συγκροτημάτων γονιδίων αντοχής σε ποικιλία αντιβιοτικών (νησίδες πολλαπλής αντοχής). Η συγκρότηση των νησίδων πολλαπλής αντοχής γίνεται με την απόκτηση νέων γονιδίων αντοχής με τη βοήθεια κινητών γενετικών μονάδων, όπως οι αλληλουχίες εισδοχής, τα μεταθετά στοιχεία και τα ιντεγκρόνια. Τα συγκροτήματα αυτά φέρονται συνήθως από μεταφερόμενα πλασμίδια, γεγονός που αυξάνει δραστικά τη δυνατότητα διασποράς τους. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η εκ μέρους διερεύνηση των μηχανισμών συγκρότησης, έκφρασης και διακυτταρικής μετακίνησης των δομών αυτών. Για το σκοπό αυτό, προσδιορίστηκε το σύνολο των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών δύο διαφορετικών πολυανθεκτικών πλασμιδίων, του p3521 και του pNL194. Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων αντοχής της μεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τόσο σε επίπεδο μεταγραφής όσο και σε επίπεδο μεταφράσεως. Η μελέτη των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των δύο πλασμιδίων υπέδειξε την ύπαρξη μιάς γενικής κοινής εξελικτικής διαδικασίας. Αμφότερα τα πλασμίδια αποτελούσαν χαρακτηριστικά παραδείγματα MDR (Multidrug resistance region) πλασμιδίων, τα οποία αποτελούταν από ένα συνεχές πλασμιδιακό τμήμα και μια αποκτηθείσα περιοχή. Οι αποκτηθείσες περιοχές και των δύο πλασμιδίων είχαν δημιουργηθεί από την εισαγωγή πληθώρας κινητών γενετικών στοιχείων, τα οποία έφεραν γονίδια αντοχής. Η αρχική εισαγωγή ενός μεταθετού στοιχείου εντός ενός διαθέσιμου πλασμιδιακού γονιδίου πιθανά δημιούργησε μία περιοχή με προδιάθεση για την εισαγωγή επιπρόσθετων αλληλουχιών που σχετίζονται με τρανσποζόνια και αλληλουχίες εισδοχής. Η μωσαϊκή τους μορφή δείχνει ότι, τουλάχιστον ως ένα βαθμό, η συσσώρευση αυτή γίνεται τυχαία. Ο χαρακτηρισμός των δύο νέων τύπων β-λακταμάσων, που κωδικοποιούταν από την αλληλουχία του πλασμίδιου p3521, έδειξε ότι: η β-λακταμάση SCO-1 σχετίζεται φυλογενετικά με την RTG ομάδα των καρβενικιλλινασών και είναι το πρώτο πλασμιδιακό ένζυμο που έχει περιγραφεί στην ομάδα αυτή. Το blaSCO-1 γονίδιο είναι πιθανά χρωμοσωμικής προέλευσης. Η β-λακταμάση ACC-4 είναι μέλος της ομάδας των πλασμιδιακών κεφαλοσπορινασών που προέρχονται από το χρωμόσωμα της Hafnia alvei. Η αντικατάσταση της βαλίνης από γλυκίνη στη θέση 211 σε σχέση με την ACC-1 ενισχύει σημαντικά την υδρολυτική ικανότητα του ενζύμου έναντι των νεότερων κεφαλοσπορινών. Ο αυξημένος ρυθμός υδρόλυσης των κεφαλοσπορινών από την ACC-4 πιθανά οφείλεται στη διεύρυνση του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων-κασετών της μεταβλητής περιοχής των τάξης 1 ιντεγκρονίων έδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις στην ισχύ των υποκινητών που καθορίζουν τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων-κασετών της μεταβλητής περιοχής. Ο ‘υβριδικός 2’ τύπος του Pc είναι ένας αποτελεσματικός υποκινητής ισχυρότερος του ‘υβριδικού 1’, και η ενεργή μορφή του P2 προσφέρει προσθετικό αποτέλεσμα στην υποκινητική δράση οποιουδήποτε τύπου Pc. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η ύπαρξη των μικρών ORFs εντός του κύριου σημείου ανασυνδυασμού (attI1) προάγει τη μετάφραση των καθοδικά ευρισκόμενων γονιδίων-κασετών. Διατυπώνεται η υπόθεση ότι οι SD αλληλουχίες των μικρών ORFs προστατεύουν τα μόρια του mRNA από ενζυμική διάσπαση διασφαλίζοντας την έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων αντοχής.