Μελέτη της έκφρασης γονιδίων και πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην εμφάνιση άσηπτης νέκρωσης των οστών

Abstract

INTRODUCTION: Osteonecrosis (ON) is a disease leading to femoral head (FH) destruction. Osteoblasts and osteoclasts balance is very important for the maintenance of bone mass. Molecules involved in the development and differentiation of these cells are BMPs, the group of OPG-RANK-RANKL and cytokines. In this study the expression of BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, OPG, RANKL και RANKL genes was analyzed between the normal and the necrotic area of the FH of patients with ON. Also, the presence or absence of certain cytokines gene polymorphisms for the IL-1a/IL-1R/IL-1RA/IL-4Rα/IL-1β/IL-12/γIFN/TGF-β/TNF-α/IL-2/IL-4/IL-6/IL-10 genes were analyzed in ON patients. MATERIAL-METHODS: Quantitative RT-PCR for the mentioned genes was performed in the normal and necrotic site of 42 FHs with ON, retrieved during surgical procedures (total hip arthroplasties) for the treatment of ON FHs. Protein levels were estimated by Western Blot analysis. As far as cytokines polymorphisms are concerned, DNA was extracted from 112 patients and 438 healthy individuals. DNA analysis was performed by the PCR-SSP method and the use of the Protrans kit. Statistical analysis was performed using the t-test (p<0.05). RESULTS: mRNA levels of BMP-2 and BMP-6 were higher in the normal area than the necrotic (BMP-2 and BMP-6, normal vs necrotic: 16.8 vs 6.8 and 1.75 vs 1.64, respectively), while BMP-4 was higher in the necrotic area. OPG, RANKL and RANK mRNA levels were higher in the necrotic area (normal vs necrotic, OPG: 3.53 vs 4.45, RANK: 0.83 vs 0.98, RANKL: 0.27 vs 0.77). In the protein level, BMP-2 was higher in the normal, while BMP-4 and BMP-6 in the necrotic area (normal vs necrotic: BMP-2: 0.67 vs 0.64, BMP-4: 0.51 vs 0.61, BMP-6: 0.52 vs 0.56). However, no divergence for BMP-7 mRNA and protein levels were observed between the normal and the necrotic area. In addition, OPG and RANKL proteins were higher in the necrotic regions ((normal vs necrotic, OPG: 0.57 vs 0.62, RANKL: 0.48 vs 0.50), while RANK protein could not be estimated. Finally, genotyping of cytokines revealed that the genotypes of TC (-889) of IL-1α and GA (-238) of TNFa are more prevalent in the patients than the healthy individuals, while the CC (codon 25) genotype of TGF-β and GG (-1082) of IL-10 are more prevalent in the healthy donors (p<0.05). CONCLUSIONS: Differential expression levels of BMPs and OPG-RANK-RANKL genes between the normal and the necrotic area suggest the important and different role these molecules have in ON progression. Moreover, this study shows a differential expression mechanism for the above genes between the normal and the necrotic area of the FHs. The absence of homogeneity (especially in the necrotic area) between the levels of mRNA and the corresponding proteins, indicate the existence of post-transcriptional mechanisms that regulate the expression of these genes in this particular area. The genotyping of the cytokines polymorphisms suggests that the presence of one or the simultaneous carriage of more than one of the above mentioned polymorphisms may further increase the risk of osteonecrosis, especially in those people receiving corticosteroids.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η οστεονέκρωση (ΟΝ) είναι μια νόσος που οδηγεί σε καταστροφή της μηριαίας κεφαλής (ΜΚ). Η ισορροπία μεταξύ οστεοβλαστών-οστεοκλαστών είναι πολύ σημαντική για την οστική μάζα και ορισμένα από τα μόρια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων είναι οι BMPs, η ομάδα των OPG-RANK-RANKL καθώς και οι κυτταροκίνες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η έκφραση των BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, OPG, RANKL και RANKL σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο, στη φυσιολογική και νεκρωτική περιοχή των ΜΚ ασθενών με ΟΝ. Επίσης μελετήθηκε η παρουσία ή απουσία πολυμορφισμών των γονιδίων των κυτταροκινών IL-1a/IL-1R/IL-1RA/IL-4Rα/IL-1β/IL-12/γIFN/TGF-β/TNF-α/IL-2/IL-4/IL-6/IL-10 σε ασθενείς με ΟΝ. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ: Η έκφραση των παραπάνω γονιδίων μελετήθηκε με ποσοτική RT-PCR σε φυσιολογική και νεκρωτική περιοχή 42 ΜΚ, που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης ολικής αρθροπλαστικής ισχίου. Τα επίπεδα των αντίστοιχων πρωτεϊνών μελετήθηκαν με τη Western Blot ανάλυση. Όσον αφορά τους πολυμορφισμούς των κυτταροκινών, απομονώθηκε DNA από το περιφερικό αίμα 112 ασθενών με ΟΝ και 438 φυσιολογικών ατόμων. Το DNA μελετήθηκε με την PCR-SSP μέθοδο και τη χρήση του Protrans kit. Η στατιστική ανάλυση έγινε με χ2-test (p<0.05). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα επίπεδα mRNA μεταγράφων των BMP-2 και BMP-6 γονιδίων ήταν υψηλότερα στη φυσιολογική περιοχή σε σχέση με τη νεκρωτική (BMP-2 και BMP-6, φυσιολογική vs νεκρωτική: 16,8 vs 6,8 και 1,75 vs 1,64, αντίστοιχα) σε αντίθεση με την BMP-4 που ήταν υψηλότερη στη νεκρωτική περιοχή. Τα επίπεδα μεταγράφων OPG, RANKL και RANK ήταν υψηλότερα στη νεκρωτική περιοχή (φυσιολογική vs νεκρωτική, OPG: 3,53 vs 4,45, RANK: 0,83 vs 0,98, RANKL: 0,27 vs 0,77). Στο πρωτεϊνικό επίπεδο, η BMP-2 ήταν υψηλότερη στη φυσιολογική περιοχή, ενώ οι BMP-4 και BMP-6 στη νεκρωτική (φυσιολογική vs νεκρωτική: BMP-2: 0,67 vs 0,64, BMP-4: 0,51 vs 0,61, BMP-6: 0,52 vs 0,56). H έκφραση της BMP-7, τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, δεν εμφάνισε καμία διαφορά μεταξύ φυσιολογικής και νεκρωτικής περιοχής. Επίσης τόσο η πρωτεΐνη OPG όσο και η RANKL ήταν υψηλότερες στη νεκρωτική περιοχή (φυσιολογική vs νεκρωτική, OPG: 0,57 vs 0,62, RANKL: 0,48 vs 0,50), ενώ η RANK δεν ήταν δυνατό να μετρηθεί. Τέλος από την γονοτύπηση των κυτταροκινών προέκυψε πως οι γονότυποι TC (θέση -889) της IL-1α και ο GA (θέση -238) του TNFa είναι συχνότεροι στους ασθενείς σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα, ενώ αντίθετα ο γονότυπος CC (codon 25) του TGF-β και ο GG (θέση -1082) της IL-10 είναι συχνότεροι στα φυσιολογικά άτομα (p<0.05). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των BMPs και των OPG-RANK-RANKL γονιδίων μεταξύ φυσιολογικής και νεκρωτικής περιοχής υποδεικνύουν τον καθοριστικό ρόλο αλλά και τη διαφορετικού βαθμού συμμετοχή των μορίων αυτών στην ανάπτυξη της OΝ. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη υποδεικνύει ένα διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης των παραπάνω γονιδίων ανάμεσα στη φυσιολογική και νεκρωτική περιοχή των ΜΚ. Η παρατήρηση ανομοιογένειας (ειδικά στην νεκρωτική περιοχή) των επιπέδων των mRNA και των αντίστοιχων πρωτεϊνών, υποδεικνύει την ύπαρξη μετα-μεταγραφικών μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση των παραπάνω γονιδίων ειδικά σε αυτή την περιοχή. Η μελέτη των συχνοτήτων των πολυμορφισμών και η σύνδεση ορισμένων γονοτύπων με την ομάδα των ασθενών, υποδεικνύει πως η παρουσία ενός ή και περισσοτέρων από τους προαναφερθέντες πολυμορφισμούς μπορεί να συμβάλει στον κίνδυνο εμφάνισης οστεονέκρωσης, ιδιαίτερα σε άτομα με υψηλό κίνδυνο όπως οι χρήστες κορτικοστεροειδών