Ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μεθόδων προσδιορισμού αντιεπιληπτικών φαρμάκων σε βιολογικά υλικά: εφαρμογές στην κλινική και δικαστική τοξικολογία

Abstract

The aim of this thesis was the development, optimization and validation of gas chromatography-mass spectrometric methods for the simultaneous determination of antiepileptic drugs, in plasma and whole blood. During the method development, the necessity appeared for separation of the antiepileptics according to their chemical behavior. So, two methods were actually developed and validated, one for the determination of the nine alkaline antiepileptics (ethosuximide, carbamazepine, lacosamide, lamotrigine, levetiracetam, oxcarbazepine, phenobarbital, phenytoin and topiramate) and two metabolites (10,11-epoxide-carbamazepine and 10-hydroxy-carbazepine), and one for the antiepileptics with acidic (valproic acid and tiagabine) and zwitterionic (gabapentin, pregabalin and vigabatrin) behavior. The sample pretreatment included protein precipitation with acetonitrile, solid phase extraction and derivatization using MTBSTFA with 1% TBDMSCl at 70oC for 30min. Levetiracetam-d6 was used as internal standard for the determination of alkaline antiepileptics, whereas gabapentin-d10 was used for the acidic and zwitterionic antiepileptics. The validation of the methods included the evaluation of: selectivity, specificity and linearity, limits of detection and quantification, intra- and inter-day accuracy and precision, absolute recovery of the methods and the stability of analytes in spiked blood samples. The developed methods were applied for therapeutic antiepileptic drug monitoring and for the toxicological investigation of clinical and forensic cases.

Ο σκοπός της διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού αντιεπιληπτικών φαρμάκων σε δείγματα πλάσματος και ολικού αίματος. Κατά την ανάπτυξη της μεθοδολογίας, προέκυψε η ανάγκη διαχωρισμού των υπό μελέτη φαρμάκων ανάλογα με τη χημική συμπεριφορά τους. Έτσι, αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν δύο μέθοδοι, μία για τον προσδιορισμό των εννέα αλκαλικών αντιεπιληπτικών φαρμάκων (αιθοσουξιμίδη, καρβαμαζεπίνη, λακοσαμίδη, λαμοτριγίνη, λεβετιρακετάμη, οξυκαρβαζεπίνη, τοπιραμάτη, φαινοβαρβιτάλη και φαινυτοΐνη) και των δύο μεταβολιτών (10,11-εποξειδιο-καρβαμαζεπίνη, 10-υδροξυ-καρβαζεπίνη), και μία για τα φάρμακα με την όξινη (βαλπροϊκό οξύ και τιαγκαμπίνη) ή επαμφοτερίζουσα (βιγκαμπατρίνη, γκαμπαπεντίνη και πρεγκαμπαλίνη) συμπεριφορά. Η κατεργασία των βιολογικών δειγμάτων περιελάμβανε καταβύθιση πρωτεϊνών με ακετονιτρίλιο, εκχύλιση στερεής φάσης και παραγωγοποίηση χρησιμοποιώντας MTBSTFA με 1% TBDMSCl στους 70οC για 30 λεπτά. Στις μεθόδους χρησιμοποιήθηκε η λεβετιρακετάμη-d6 ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό των αλκαλικών αντιεπιληπτικών και η γκαμπαπεντίνη-d10 για τον προσδιορισμό των όξινων και επαμφοτεριζόντων αντιεπιληπτικών. Οι παράμετροι επικύρωσης των μεθόδων ήταν: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός της ημέρας και δια των ημερών, απόλυτη ανάκτηση και ανθεκτικότητα των μεθόδων, καθώς και σταθερότητα των αναλυτών σε εμβολιασμένα δείγματα αίματος. Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι εφαρμόστηκαν στην παρακολούθηση των θεραπευτικών επιπέδων αντιεπιληπτικών φαρμάκων και στην τοξικολογική διερεύνηση περιστατικών κλινικού και δικαστικού ενδιαφέροντος.