Η επίδραση της εφελκυστικής τάσης στους αποπτωτικούς μηχανισμούς επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων και κυψελιδικών μακροφάγων

Abstract

Over the past few years clinical evidence has shown that mechanical ventilation may be associated with inflammatory reaction. In the present study we have analyzed the effects of mechanical stretch on lung apoptosis and inflammation. We used lung carcinoma epithelial cells (A459 and MLE12 cell lines) human umbilical vein endothelial cells and alveolar macrophages from mechanically ventilated patients subjected to bronchoalveolar lavage. Cells were subjected upon mechanical stretch for different time periods and we examined their viability under the specific experimental conditions. TNFa and CH11 were used as proinflammatory and proapoptotic factors respectively. Cytosolic (cPLA2) and secretory (sPLA2) phospholipases A2 were used as proinflammatory markers. Apoptosis was assessed by flow cytometry PLA₂s production and expression were followed by Western Blotting and RT PCR respectively a) stretch caused a significant increase in A459 cell line and endothelial cell apoptosis while MLE12 and alveolar macrophages did not respond, b) TNF-a induced apoptosis in endothelial cells but blocked the proapoptotic effect of CH11 in A549 cells, c) Treatment with ch11 and stretch in combination led to a significant increase of sPLA₂ levels in A459 cells while neither stretch nor CH11 alone had such an effect, d) Overall cell response to mechanical stretch seemed to be time depended A549 cell line underwent apoptosis after 24 hours of mechanical stretch while endothelial cells after 4 hours. Our results suggest that stretch has a proapoptotic effect on epithelial and endothelial cells. The combination of stretch with chemical pro-apoptotic signals can activate at the same time proapoptotic and pro-inflammatory pathways.

Ο μηχανικός αερισμός αποτελεί βασικό τρόπο υποστήριξης των βαρέως πασχόντων ασθενών. Πρόσφατα κλινικά δεδομένα δείχνουν ωστόσο πως ο μηχανικός αερισμός προκαλεί φλεγμονή αντίδραση στο πνευμονικό παρέγχυμα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί αν πράγματι τα μηχανικά σήματα ενεργοποιούν την απόπτωση και φλεγμονή στον πνεύμονα. Ως κυτταρικά μοντέλα εξετάστηκαν: α) οι σειρές Α549 MLE12 (μοντέλα πνευμονοκυττάρων τύπου II), β) πρωτογενείς καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων απομονωμένων από ομφάλιο λώρο και γ) κυψελιδικά μακροφάγα που απομονώθηκαν από βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) ασθενών που υπόκεινται σε μηχανικό αερισμό. Τα κύτταρα υπέστησαν μηχανικό εφελκυσμό (stretch) για διάφορα χρονικά διαστήματα με ειδική πειραματική διάταξη και ελέγχθηκε η δυνατότητα να καλλιεργηθούν και να επιβιώσουν υπό τις πειραματικές μας συνθήκες. Ως σήμα που επάγει τη φλεγμονή και την απόπτωση αντίστοιχα χρησιμοποιήθηκαν ο TNFa και ο CH-11. Η απόπτωση ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ως δείκτες φλεγμονής χρησιμοποιήθηκαν η κυτοσολική και εκκρινόμενη φωσφολιπάση Α₂ (cPLA₂, sPLA₂) που ανιχνεύθηκαν με ανοσοαποτύπωση, ενώ η επαγωγή της έκφρασης διερευνήθηκε με RT-PCR. Τα αποτελέσματα της εργασίας συνοπτικά είναι: 1. Η τάση εφελκυσμού ενεργοποιεί την απόπτωση σε διαφορετικό βαθμό στα υπό εξέταση μοντέλα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα Α549 αποπίπτουν ενώ τα MLE12 και τα κυψελιδικά μακροφάγα όχι. 2. Ο TNFa επάγει την απόπτωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα σε αντίθεση με τα κύτταρα Α549 στα οποία περιορίζει την αποπτωτική δράση του μεσολαβητή CH11. 3. Σε κύτταρα Α549 συνδυασμός stretch και CH11 οδήγησε στην παράλληλη αύξηση της απόπτωσης και παραγωγής εκκρινόμενης φωσφολιπάσης Α₂, ενώ κάθε ερέθισμα από μόνο του δεν παρουσίασε τέτοια επίδραση. 4. Σε όλες τις περιπτώσεις η απόκριση των κυττάρων εξαρτάται από τη διάρκεια του μηχανικού ερεθίσματος ή τη συγκέντρωση του χημικού ερεθίσματος. Στα κύτταρα Α549 παρατηρείται απόπτωση μετά από 24 ώρες stretch, ενώ στα ενδοθηλιακά μετά από 4 ώρες. Συμπερασματικά, το stretch επάγει την απόπτωση σε ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κυτταρικά μοντέλα. Επιπλέον, συνδυασμός stretch με χημικά αποπτωτικά ερεθίσματα μπορούν να ενεργοποιήσουν απόπτωση και φλεγμονή ταυτόχρονα.