Μοριακοί μηχανισμοί ογκογένεσης μέσω του ιού Epstein-Barr: ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα NF-kB στη ρύθμιση της έκφρασης ιικών και κυτταρικών γονιδίων

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a gamma-herpesvirus, which is transmitted through the exchange of saliva and infects 90-95% of the human population worldwide. The viral genome has the ability to persist in the host cells in an episomal form, where it persists usually in a latent state. Occasionally, the EBV genome may integrate in the host genome. The infection by EBV remains asymptomatic when it occurs in childhood, whereas it is related to the infectious mononucleosis syndrome, when it occurs after early adulthood. Moreover, in immunocompromised persons, EBV infection may lead to several cases of cancer (lymphomas, nasopharyngeal carcinomas and others) and therefore it is related to 1% of the cancer cases, worldwide. EBV has a tropism mainly for B lymphocytes and epithelial cells and a propensity to promote the development of a large number of cancers originating from these cell types. At the molecular lever, the membrane protein LMP1 (Latent Membrane Protein 1) is the principal oncogenic factor of EBV. The oncogenic role of LMP1 originates mainly from its ability to activate the transcription factor NF-κB. The aim of the present thesis was the study of the role of the transcription factor NF-κB in EBV-mediated oncogenesis. This study was based on the identification of direct target genes of the NF-κB2/p52 subunit of NF-κB, in EBV-transformed B cells, using a combination of the Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and DNA cloning techniques (ChIP-cloning). This procedure revealed the interaction of NF-κB with sites located proximally or inside genes, involved in several physiological functions, but also in regions of the genome that are located away from any known gene. Also, a novel NF-κB-binding site was identified and characterized, which is part of the Alu repetitive elements. Another aim of the present thesis was the study of the transcription regulation of LMP1, through the characterization of transcription factor-binding sites in its promoter sequence. This study revealed the existence of a complex network of protein interactions within the promoter region of LMP1 and the presence of positive autoregulatory circuits which involve the NF-κB transcription factor. Consequently, the present thesis has shed light on the multifunctional role of the transcription factor NF-κB in the regulation of viral and cellular genes and has revealed new mechanisms of action of this transcription factor.

Ο EBV είναι ένας γ-ερπητοϊός, ο οποίος μεταδίδεται μέσω της ανταλλαγής σιέλου και μολύνει το 90-95% του ανθρώπινου πληθυσμού. Έχει την ικανότητα να διατηρεί το γονιδίωμα του στα κύτταρα του ξενιστή υπό μορφή επισώματος, όπου παραμένει συνήθως σε λανθάνουσα φάση, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις το γονιδίωμά του μπορεί να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η μόλυνση είναι ασυμπτωματική όταν συμβαίνει στην παιδική ηλικία, ενώ όταν λαμβάνει χώρα μετά την ενηλικίωση, σχετίζεται με το σύνδρομο της λοιμώδους μονοπυρήνωσης. Επιπλέον, σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα, οδηγεί στην εμφάνιση διαφόρων μορφών καρκίνου (λεμφώματα, ρινοφαρυγγικά καρκινώματα) και έτσι σχετίζεται με 1% επί του συνολικού αριθμού των περιστατικών καρκίνου, παγκοσμίως. Παρουσιάζει τροπισμό προς τα Β λεμφοκύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα, καθώς και ικανότητα να οδηγεί στην ανάπτυξη μεγάλου αριθμού νεοπλασιών που προέρχονται από τα κύτταρα αυτά. Σε μοριακό επίπεδο, η ιική πρωτεΐνη που παίζει πρωταρχικό ρόλο στον κυτταρικό μετασχηματισμό από τον EBV είναι η μεμβρανική πρωτεΐνη LMP1 (Latent Membrane Protein 1). Ο ογκογόνος ρόλος της LMP1 βασίζεται σε σημαντικό βαθμό στην ικανότητα της να ενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα NF-κB. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στην ογκογόνο δράση του ιού EBV. Η μελέτη αυτή βασίστηκε στην ταυτοποίηση άμεσων γονιδίων-στόχων του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB2/p52, σε κύτταρα μετασχηματισμένα από τον ιό EBV με την τεχνική ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP) σε συνδυασμό με τεχνικές κλωνοποίησης. Η διαδικασία αυτή αποκάλυψε την αλληλεπίδραση του NF-κB με περιοχές που γειτνιάζουν με γονίδια που εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες αλλά και περιοχές που βρίσκονται σε μεγάλες αποστάσεις από γνωστά γονίδια. Eπίσης, ταυτοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε μία νέα νουκλεοτιδική αλληλουχία δέσμευσης του NF-κB που βρίσκεται σε ακολουθίες Alu. Ταυτόχρονα, στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η ρύθμιση της έκφρασης της LMP1, μέσω της μελέτης θέσεων δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της. Η μελέτη αυτή κατέδειξε την ύπαρξη ενός πολύπλοκου δικτύου αλληλεπιδράσεων διαφόρων πρωτεϊνών με την περιοχή του υποκινητή της LMP1 (LMP1p) και την παρουσία κυκλωμάτων θετικής αυτορύθμισης της έκφρασης της ιικής πρωτεΐνης που περιλαμβάνουν το μεταγραφικό παράγοντα NF-κB. Η παρούσα διατριβή κατέδειξε τον πολύπλευρο ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στη ρύθμιση ιικών και κυτταρικών γονιδίων και αποκάλυψε νέους μηχανισμούς δράσης του μεταγραφικού αυτού παράγοντα.