Η επίδραση της μηχανικής τάσης στο πνευμονικό ενδοθήλιο και επιθήλιο

Abstract

Overdistension of the lung during mechanical ventilation can cause lung injury characterized by increased permeability pulmonary edema and inflammation (Ventilator- Induced Lung Injury, VILI). The mechanisms that are activated during VILI are not fully understood and their investigation is very important so that therapeutic strategies are designed. The aim of this work was to study the signal transduction mechanisms involved in VILI in vivo and in vitro and to investigate a possible pharmacological intervention. Therefore we studied the effect of inhaled activated protein C (rhAPC) on lung injury induced by ventilation. C57/Bl6 mice and lung endothelial and epithelial cell cultures were used. In vivo, mice received injurious mechanical ventilation with high tidal volume (HVt, 25 mL/kg). HVt mechanical ventilation induced lung tissue inflammation, edema formation and thrombin production. HVt also caused activation of Src, ERK 1/2 and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in lung tissues. Then we investigated the effect of APC which is an anticoagulant with anti-inflammatory actions, on lung injury induced by HVt mechanical ventilation. APC prevented pulmonary edema development measured as protein permeability and respiratory system elastance. Lung tissue and airspace neutrophil infiltration, assessed by myeloperoxidase activity and bronchoalveolar lavage absolute neutrophil counts were attenuated in mice treated with APC. APC also, reduced levels of activated ERK 1/2 in lung tissues, indicating a possible mechanism of its action. In vitro, we found a rapid and transient activation of PI-PLC by mechanical stretch. In separate experiments, thrombin induced activation of the signaling pathway Src/ERK /cPLA2 in lung cells, but thrombin-induced cPLA2 activation was inhibited in the presence of APC. Our results indicate that inhaled APC could be useful in preventing pulmonary injury from high tidal volume mechanical ventilation in mice. This protective effect could be explained by the fact that APC can alter the signaling pathways activated in cells during VILI.

Ο μηχανικός αερισμός μπορεί να προκαλέσει πνευμονική βλάβη που χαρακτηρίζεται από οίδημα και φλεγμονή (Ventilator- Induced Lung Injury, VILI). Οι παθογενετικοί μηχανισμοί του VILI, δεν είναι ωστόσο πλήρως διευκρινισμένοι και η διερεύνησή τους καθίσταται ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθούν οι μηχανισμοί σηματοδότησης που ενεργοποιούνται στο VILI in vivo και in vitro και να διερευνηθεί η δυνατότητα φαρμακολογικής παρέμβασης στους μηχανισμούς αυτούς. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε η δράση εισπνεόμενης ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C (rhAPC) σε πειραματικό VILI και εκτιμήθηκε η επίδρασή της στην πνευμονική λειτουργία και στη ρύθμιση σηματοδοτικών οδών. Για τις in vivo μελέτες χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια C57/Bl6 ενώ in vitro μελετήθηκαν καλλιέργειες ενδοθηλιακών και επιθηλιακών πνευμονοκυττάρων. Στο in vivo μοντέλο, στο οποίο τα πειραματόζωα τέθηκαν σε μηχανικό αερισμό με υψηλό (HVt, 25 mL/kg) αναπνευστικό όγκο, παρατηρήθηκε πνευμονική βλάβη με επιδείνωση της πνευμονικής λειτουργίας και ιστολογικά στοιχεία φλεγμονής. Σε μοριακό επίπεδο βρέθηκε ενεργοποίηση των Src, ERK 1/2 και της κυτοσολικής φωσφολιπάσης Α2 (cPLA2) σε πνευμονικά εκχυλίσματα με ανοσοαποτύπωση καθώς και αυξημένη παραγωγή θρομβίνης, σημαντικού μεσολαβητή της πήξης και της φλεγμονής. Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση της rhAPC, που χαρακτηρίζεται για τις αντιφλεγμονώδεις και αντιπηκτικές ιδιότητές της, στο μοντέλο VILI. Παρατηρήθηκε ότι η rhAPC αναστέλλει την επιδείνωση της πνευμονικής λειτουργίας από μηχανικό αερισμό με HVt, την αύξηση της διαπερατότητας (ολική πρωτεΐνη BAL) και τη διήθηση των ουδετερόφιλων στον πνευμονικό ιστό και στον κυψελιδικό χώρο (ενεργότητα της μυελοϋπεροξειδάσης, πλήθος ουδετερόφιλων στο BAL). Επίσης, η χρήση rhAPC οδήγησε σε αναστολή της ενεργοποίησης ERK στα κυψελιδικά κύτταρα, αναδεικνύοντας έναν πιθανό μηχανισμό δράσης της rhAPC. Ως προς τη μεταγωγή μηχανικού σήματος στα πνευμονοκύτταρα, βρέθηκε ταχεία και παροδική (στα 30’’) ενεργοποίηση της PIPLC. Σε καλλιέργειες πνευμονοκυττάρων βρέθηκε επίσης ότι επώαση με θρομβίνη, οδηγεί σε ενεργοποίηση του μονοπατιού Src/ERK/cPLA2. Η ενεργοποίηση ωστόσο της cPLA2 από τη θρομβίνη αναστέλλεται σημαντικά παρουσία APC. Συμπερασματικά στην παρούσα εργασία διαπιστώσαμε ότι η χορήγηση εισπνεόμενης rhAPC σε μοντέλο VILI προστατεύει τον πνεύμονα περιορίζοντας την ανάπτυξη οιδήματος και τη φλεγμονώδη απόκριση. H δράση αυτή δείχνει να οφείλεται σε παρεμβολή της APC στους σηματοδοτικούς μηχανισμούς που λαμβάνουν χώρα στο πνευμονικό επιθήλιο υπό την επίδραση μηχανικής τάσης και φλεγμονωδών μεσολαβητών.