Λειτουργική ανάλυση της 14-3-3ε και συγγενών ισόμορφων θηλαστικών στη Drosophila melanogaster

Abstract

The 14-3-3 proteins comprise a family of small acidic molecules with multiple and apparently diverse cellular functions (enhancement of protein-protein interaction, suppression of protein-protein interaction, regulation of catalytic activity, regulation of protein sub-cellular localization, protection of proteins from modification/ enhancement of stability). 14-3-3 proteins are dimers and they have the ability to create homo- and hetero- dimers. The dimerization of 14-3-3 proteins seems to have a functional role. The combination of homo- and hetero- dimmers may be responsible for the specification of these proteins concerning their protein targets. The 14-3-3 isotypes appear to be highly specific regarding their ability and their affinity to bind to protein targets despite their conserved protein structure. Previous experimental research has shown that 14-3-3 proteins are involved, among others, in three major procedures: cell cycle, apoptosis and cell signaling. 14-3-3 proteins play an important role in the diseases of the nerve system and oncogenesis. The functional specialization or redundancy of the ubiquitous 14-3-3 proteins constitutes a fundamental question in their biology and stems from their highly conserved structure and multiplicity of coexpressed isotypes. We address this question in vivo using mutations in the two Drosophila 14-3-3 genes, leonardo (14-3-3ζ) and D14-3-3ε. We demonstrate that D14-3-3ε is essential for embryonic hatching. Nevertheless, D14-3-3ε null homozygotes survive because they upregulate transcripts encoding the LEOII isoform at the time of hatching, compensating D14-3-3ε loss. This novel homeostatic response explains the reported functional redundancy of the Drosophila 14-3-3 isotypes and survival of D14-3-3ε mutants. The response appears unidirectional, as D14-3-3ε elevation upon LEO loss was not observed and elevation of leo transcripts was stage and tissue specific. In contrast, LEO levels are not changed in the wing disks, resulting in the aberrant wing veins characterizing D14-3-3ε mutants. Nevertheless, conditional overexpression of LEOI, but not of LEOII, in the wing disk can partially rescue the venation deficits. Thus, excess of a particular LEO isoform can functionally compensate for D14-3-3ε loss in a cellular-context-specific manner. These results demonstrate functional differences both among Drosophila 14-3-3 proteins and between the two LEO isoforms in vivo, which likely underlie differential dimer affinities toward 14-3-3 targets. Following the previous data, we examined the effect of the D14-3-3ε mutations in the Drosophila germ line system. We aimed to elucidate the role of the D14-3-3ε protein in this system and determine if the two Drosophila isoforms, LEO and D14-3-3ε, are redundant. More specifically, we show that D14-3-3ε mutants are sterile. This phenotype is due to abnormal pole cell migration, which results in the formation of gonads with reduced number of germ cells. Over-expression of LEO is not capable to rescue this phenotype, which proves that D14-3-3ε is not fully redundant with LEO, regarding this particular function. Finally, we present data showing that D14-3-3ε affects the expression or the stability of the transcription factor zinc-finger homeodomain-1, which is one of the regulating molecules in the migration of pole cells.

Η οικογένεια των πρωτεϊνών 14-3-3 αποτελείται από μία ομάδα μικρών σε μοριακό βάρος, όξινων πρωτεϊνών με πολλαπλές και καθώς φαίνεται διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες (ενίσχυση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, καταστολή πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ρύθμιση καταλυτικής δράσης, ρύθμιση υποκυτταρικού εντοπισμού, αποτροπή τροποποίησης πρωτεϊνών/ενίσχυση σταθερότητας). Οι πρωτεΐνες 14-3-3 είναι διμερείς και έχουν την ικανότητα να δημιουργούν ομοδιμερή και ετεροδιμερή και ο διμερισμός των πρωτεϊνών 14-3-3 φαίνεται να έχει λειτουργικό χαρακτήρα. Ο συνδυασμός ομο- και ετεροδιμερών μπορεί να είναι υπεύθυνος για την εξειδίκευση των πρωτεϊνών 14-3-3 ως προς τις πρωτεΐνες στόχους. Οι ισότυποι 14-3-3 φαίνεται να εμφανίζουν εξειδίκευση ως προς την ικανότητα αλλά και τη συγγένεια πρόσδεσης τους με πρωτεΐνες-στόχους παρόλη την υψηλή συντήρηση στην πρωτεϊνική τους αλληλουχία. Οι πολυετείς πειραματικές αναζητήσεις της λειτουργίας των πρωτεϊνών 14-3-3 έδειξαν ότι εμπλέκονται, μεταξύ άλλων, σε τρεις βασικές κυτταρικές διαδικασίες, τον κυτταρικό κύκλο, την απόπτωση και την κυτταρική σηματοδότηση. Οι πρωτεΐνες 14-3-3 φαίνεται να εμπλέκονται σε ασθένειες του νευρικού συστήματος αλλά και στην ογκογένεση. Ένα από τα θεμελιώδη ερωτήματα στη βιολογία των 14-3-3 πρωτεϊνών, το οποίο πηγάζει από την υψηλά συντηρημένη δομή τους και την ύπαρξη πολλαπλών συνεκφραζόμενων ισοτύπων, αφορά στη λειτουργική εξειδίκευση των διαφορετικών ισομορφών και την ικανότητα τους να αναπληρώνουν η μία ισομορφή την έλλειψη της άλλης. Στην συγκεκριμένη εργασία θέτουμε αυτό το ερώτημα in vivo, χρησιμοποιώντας μεταλλάξεις στα δύο Δροσοφιλικά γονίδια, Leonardo (14-3-3ζ) και D14-3-3ε. Δείχνουμε ότι η πρωτεΐνη 14-3-3ε είναι σημαντική για την εκκόλαψη του εμβρύου. Εντούτοις, ομοζυγώτες με μηδενική έκφραση 14-3-3ε πρωτεΐνης, επιβιώνουν γιατί υπερρυθμίζουν την παραγωγή μεταγράφων που κωδικοποιούν την ισομορφή LEOII την στιγμή της εκκόλαψης, που αναπληρώνει την έλλειψη της 14-3-3ε. Αυτή η νέα ανταπόκριση του ομοιοστατικού μηχανισμού εξηγεί την ικανότητα λειτουργικής αναπλήρωσης μεταξύ των δροσοφιλικών 14-3-3 πρωτεϊνών καθώς και την επιβίωση των 14-3-3 ομοζυγωτών. Η ανταπόκριση αυτή φαίνεται να είναι μονόδρομη και όχι αμφίδρομη, αφού σε περιπτώσεις απώλειας της πρωτεΐνης LEO δεν παρατηρήθηκε άνοδος των επιπέδων της D14-3-3ε, καθώς και η αύξηση του επιπέδου μεταγραφής της πρωτεΐνης LEO εξαρτάται από το αναπτυξιακό στάδιο και τον ιστό. Αντίθετα, τα επίπεδα της LEO δεν φαίνονται να αλλάζουν στους εμβρυικούς δίσκους του φτερού, καταλήγοντας στο μη φυσιολογικό σχηματισμό φλέβας του φτερού, που χαρακτηρίζει τους 14-3-3ε ομοζυγώτες. Παρόλα αυτά, συνθήκες υπερέκφρασης της LEOI, αλλά όχι της LEOII, στο δίσκο του φτερού, μπορούν να αναστρέψουν εν μέρει το φαινότυπο ανεπαρκούς φλέβωσης. Επομένως, υπερπληθώρα συγκεκριμένης ισομορφής της πρωτεΐνης LEO, σε συγκεκριμένο κυτταρικό περιβάλλον, μπορεί να αναπληρώσει λειτουργικά της έλλειψη της πρωτεΐνης 14-3-3ε. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν, in vivo, ότι υπάρχουν λειτουργικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών 14-3-3 πρωτεϊνών της Δροσόφιλας, αλλά και ανάμεσα στις δύο ισομορφές της πρωτεΐνης 14-3-3 LEO, οι οποίες υποδηλώνουν διαφορετική συγγένεια των διμερών ως προς τα μόρια στόχους των 14-3-3 πρωτεϊνών. Σε συνέχεια των προηγούμενων δεδομένων, εξετάσαμε την επίδραση των μεταλλάξεων του γονιδίου D14-3-3ε στο γεννητικό σύστημα της Δροσόφιλας. Στόχος των πειραμάτων ήταν η διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης D14-3-3ε στο συγκεκριμένο σύστημα, καθώς και ο καθορισμός της σχέσης ισοδυναμίας ή μη με την πρωτεΐνη LEO. Συγκεκριμένα, παρουσιάζονται στοιχεία που δείχνουν ότι οι μεταλλαγμένες D14-3-3ε μύγες είναι στείρες. Ο φαινότυπος αυτός οφείλεται σε μη φυσιολογική μετανάστευση των πρώιμων γεννητικών κυττάρων κατά την εμβρυογένεση, που καταλήγει στο σχηματισμό γονάδων με μειωμένο αριθμό γεννητικών κυττάρων. Υπερέκφραση της πρωτεΐνης LEO δεν είναι ικανή να αναστρέψει αυτό το φαινότυπο, γεγονός που αποδεικνύει πως η πρωτεΐνη D14-3-3ε δεν είναι πλήρως ισοδύναμη με τη LEO σε ότι αφορά στη συγκεκριμένη λειτουργία. Τέλος, παρουσιάζουμε στοιχεία που δείχνουν πως η πρωτεΐνη D14-3-3ε επηρεάζει την έκφραση ή τη σταθερότητα του μεταγραφικού παράγοντα zinc-finger homeodomain-1, που αποτελεί ένα από τα κύρια ρυθμιστικά μόρια της μετανάστευσης των πολικών κυττάρων.