Μελέτη του προτύπου κατανομής των ιστονών κατά την διαφοροποίηση φυτικών κυττάρων

Abstract

Histones are small, basic and highly cornserved proteins, necessary in DNA compaction into the chromatin of eukaryotic cells. The primary level of chromatin formation is the nucleosome, where 146bp of DNA are wrapped around a histone octamer core, comprised of two of each core histones, H2A, H2B, H3 and H4, while its structure is completed with the association of H1 linker histone. Each histone class, with the exception of H4, is represented by a family of structurally similar polypeptides called histone variants. Histone variants are synthesized in different relative amounts during the cell cycle and it has been proposed that they could be necessary in distinct chromatin functions. On the other hand, histone post-translational modifications such as acetylation, phosphorylation, methylation and ubiquitination, provide another level of heterogeneity to these proteins and is well established that they also play important roles in all chromatin functions. Although histone variants and modifications have been identified and studied in plants, little is known about their spacial distribution during plant cell differentiation and dedifferentiation, processes that involve several alterations in chromatin structure and function. Even less is known about the effect of exogenous applied plant hormones, compounds known to regulate almost all aspects of plant development, on histone variants’ distribution. In this study we examined the distribution of histone variants and modified forms during plant cell differentiation. Maize root is an appropriate biological system for developmental studies since it consists of three zones, which can be easily separated. Meristematic and elongation zones contain proliferating cells and the primary root tissues respectively, whereas differentiation zone consists mainly of parenchymatic, nonproliferating cells. On the other hand, it is well established that during callus formation, previously differentiated plant cells restore their maristematic properties, including the ability for rapid proliferation. Finally, plant hormones like auxin and gibberellin are known to play significant roles in root growth by promoting or inhibiting root differentiation. Histones were extracted from each of the three developmental zones of maize root from control plants, from plants treated with auxin and gibberellins and also from callus cultures developed in MS medium. They were separated initially in SDS containing and subsequently in acetic acid-urea containing polyacrylamide gels, and 231 finally in two-dimensional AUT/AUC-PAGE. By means of specific antibodies, we identified the five histone classes, the linker histone H1 variants, the ubiquitinated form of H2A, the acetylated and the phosphorylated forms of H3 and the acetylated form of H4. After identifying histone classes, two-dimensional gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software, in order to estimate each histone variant’s ratio in maize root developmental zones.

Οι ιστόνες είναι μικρές, βασικές και εξαιρετικά συντηρημένες πρωτεϊνες, απαραίτητες για τη συμπύκνωση του DNA στην χρωματίνη των ευκαρυωτικών κυττάρων. Το πρώτο επίπεδο συμπύκνωσης του DNA είναι το νουκλεόσωμα, το οποίο αποτελείται από ένα οκταμερές των ιστονών Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4, στο οποίο περιελίσσονται περίπου 146bp DNA, ενώ η δομή του ολοκληρώνεται με την πρόσδεση της συνδετικής ιστόνης Η1. Κάθε τάξη ιστονών, με εξαίρεση την Η4, μπορεί να θεωρηθεί ως μία οικογένεια δομικά όμοιων πολυπεπτιδίων, που ονομάζονται ισομορφές. Οι ισομορφές των ιστονών συντίθενται σε διαφορετικές ποσότητες κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και έχει προταθεί πως είναι απαραίτητες στις διάφορες λειτουργίες της χρωματίνης. Επιπλέον, οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η ακετυλίωση, η φωσφορυλίωση, η μεθυλίωση και η ουβικουιτίνωση, δημιουργούν ένα ακόμη επίπεδο ετερογένειας των πρωτεϊνών αυτών και έχει αποδειχθεί πως παίζουν σημαντικό ρόλο σε όλες τις λειτουργίες της χρωματίνης. Παρόλο που οι ισομορφές και οι τροποποιήσεις των ιστονών έχουν μελετηθεί σε φυτικούς οργανισμούς, λίγα είναι γνωστά για το πρότυπο κατανομής τους κατά την διαφοροποίηση και την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων, διαδικασίες που περιλαμβάνουν πολλές μεταβολές στη δομή και λειτουργία της χρωματίνης. Ακόμη λιγότερα είναι γνωστά για την επίδραση που επιφέρουν στο παραπάνω πρότυπο οι φυτοορμόνες, ουσίες που ρυθμίζουν όλες σχεδόν τις διαδικασίες κατά την ανάπτυξη του φυτού. Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη του προτύπου κατανομής των ισομορφών και τροποποιημένων μορφών των ιστονών κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Η ρίζα του καλαμποκιού (Zea mays L.) αποτελεί ένα κατάλληλο βιολογικό σύστημα για αναπτυξιακές μελέτες, δεδομένου αποτελείται από τρείς ευδιάκριτες αναπτυξιακές της ζώνες. Η μεριστωματική ζώνη αποτελείται από ταχυδιαιρούμενα κύτταρα, στη ζώνη επιμήκυνσης οι κυτταροδιαιρέσεις ελαττώνονται, ενώ η ζώνη διαφοροποίησης αποτελείται κυρίως από παρεγχυματικά, μη διαιρούμενα κύτταρα. Αντίθετα, σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων τα φυτικά κύτταρα επανακτούν τις μεριστωματικές τους ιδιότητες ανεξάρτητα από το προηγούμενο βαθμό διαφοροποίησής τους. Τέλος, είναι γνωστό πως οι φυτοορμόνες, όπως η αυξίνη και η γιββεριλλίνη παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ρίζας, προάγοντας ή αναστέλλοντας αντίστοιχα τη διαφοροποίηση των κυττάρων. 228 Αρχικά έγινε απομόνωση και καθαρισμός ιστονών ξεχωριστά από κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας, από φυτά-μάρτυρες, από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και γιββεριλλίνης καθώς και από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο MS. Ακολούθησε ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των ιστονών, αρχικά με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, έπειτα με όξινη ηλεκτροφόρηση σε σύστημα οξικού οξέος-ουρίας και τέλος με δισδιάσταση όξινη ηλεκτροφόρηση AUT/AUC-PAGE.