Φαινοτυπική και γενοτυπική ανάλυση ασθενών με κυστική ίνωση από τη βόρεια Ελλάδα

Abstract

In order to study the distribution of CF mutations in northern Greece, 83 patients originated from northern Greece, were analysed initially for the 11 most common mutations (DF508, G542X, R553X, G551D, N1303K, R334W, W1282X, R117H , E822X, 621+1G>T and 1717-1G>A). The analysis allowed the identification of 66.28 % of the CF chromosomes. ΔF508 was found to be the most frequent mutation with frequency 46.98 % followed by the 621 +1G>T at a rate of 9.63 % .The high frequency of the 621+1G>T mutation in the region of northern Greece led to the association analysis of the 621+1G>T mutation with distinct haplotypes for seven polymorphic markers. Two haplotypes showed a strong association with 621+1G>T mutation (87.5 % and12.5 % respectively), while these specific haplotypes did not appear to be linked with the absence of mutation or the ΔF508, result that strengthens the origin of the mutation from Northern Greece. Next step was the screening of the 27 exons and adjacent introns, by the SSCP method, followed by DNA sequencing. Extensive analysis revealed seven known mutations (2183AA>G, 406-6T>C, M348K, 306delTAGA, 4332delTG, R297Q and 4574A>G). It is worth mentioning that the 4574A>G (X1481W) mutation, which was found in one patient in double heterozygosity with the G542X mutation, is the third case of a de novo mutation worldwide.Simultaneously the analysis detected five known polymorphisms in different regions of the gene: 125G>C (5'UTR), c.876-31delTTGA (intron 6), c.4002A>G (exon 20), 4374+13A>G (exon 23) c.4521G>A (exon 24). In the attempt to correlate the patients genotype with their phenotype, the effect of each mutation (depending on the type, class by Zielenski, position), the possible interaction of mutations in double heterozygous patients, and the contribution of the detected polymorphisms, in the clinical phenotype of patients, were tested. Significant phenotypic heterogeneity was found. The results revealed that patients who actually showed illness signs heavier than expected based on their genotype (mild and severe mutation, or a combination of two mild mutations) were carrying polymorphisms in cis position with the mild mutations, in sites as 5'UTR, exon splicing sites, or in ESE sites. These polymorphisms may affect negatively the rate of transcription and even the process of the precursor mRNA. Moreover, the correlation of the genotype with the clinical phenotype was analysed in the 83 patients from Northern Greece. Statistically significant difference was found for the type of microorganisms growing in the cultures of sputum. Furthermore statistically significant difference was found for electrolyte concentration. The possibility of the existence of other genes that may affect the differentiation of the clinical phenotype was investigated by analyzing the PRSS1 and PSTI genes, which are associated with the occurrence of idiopathic chronic pancreatitis. The main purpose was to investigate the possible modifying role of these two genes in the clinical phenotype of CF. The analysis showed that one patient with genotype ΔF508/ΔF508 was found homozygous for the A16V mutation in the PRSS1 gene. The presence of this mutation in only one patient, may be just a coincidence, or vice versa can be a strong indication of the contribution of some modifying genes in the phenotype of cystic fibrosis.

Με σκοπό τη μελέτη της κατανομής των μεταλλάξεων στη Βόρεια Ελλάδα, εξετάστηκαν 83 ασθενείς με καταγωγή από τη Β. Ελλάδα, αρχικά για τις 11 πιο συχνές μεταλλάξεις (ΔF508, G542X, R553X, G551D, N1303K, R334W, W1282X, R117H, E822X, 621+1G>T και 1717-1G>A) της κυστικής ίνωσης. Η ανάλυση επέτρεψε την ταυτοποίηση του 66,28% των χρωμοσωμάτων με ΚΙ. Πιο συχνή μετάλλαξη βρέθηκε να είναι η ΔF508 με ποσοστό 46,98%, ενώ δεύτερη σε συχνότητα ήταν η μετάλλαξη 621+1G>T με ποσοστό 9,63%. Η ψηλή συχνότητα της μετάλλαξης 621+1G>T στην περιοχή της Β. Ελλάδας οδήγησε σε ανάλυση σύνδεσης της μετάλλαξης με διακριτούς απλότυπους για επτά διαλληλομορφικούς πολυμορφικούς γενετικούς δείκτες. Προέκυψε ισχυρή σύνδεση της μετάλλαξης 621+1G>T με δύο απλότυπους (ποσοστό 87,5% και 12,5% αντίστοιχα), οι οποίοι δε φάνηκε να συνδέονται με την απουσία της μετάλλαξης ή με τη μετάλλαξη ΔF508, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση της καταγωγής της μετάλλαξης από τη Β. Ελλάδα. Η σάρωση και των 27 εξονίων και των παρακείμενων ιντρονίων, με την εφαρμογή της μεθόδου SSCP, και της ανάλυση πρωτοδιάταξης του DNA οδήγησε στην ανίχνευση επτά γνωστών μεταλλάξεων (2183AA>G, 406-6T>C, M348K, 306delTAGA, 4332delTG, R297Q και 4574A>G). Η μετάλλαξη 4574A>G (Χ1481W), η οποία βρέθηκε σε διπλή ετεροζυγωτία με τη μετάλλαξη G542X σε έναν ασθενή, αποτελεί την τρίτη περίπτωση de novo μετάλλαξης σε παγκόσμιο επίπεδο. Επίσης ανιχνεύτηκαν πέντε γνωστοί πολυμορφισμοί σε διάφορες περιοχές του γονιδίου: 125G>C, c.876-31delTTGA, c.4002A>G, 4374+13A>G και c.4521G>A. Με σκοπό την προσπάθεια συσχέτισης του γενότυπου των ασθενών με το φαινότυπό τους διερευνήθηκε η επίδραση της κάθε μετάλλαξης, η πιθανή αλληλεπίδραση των μεταλλάξεων, αλλά και η συνεισφορά των πολυμορφισμών που ανιχνεύτηκαν, στον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Διαπιστώθηκε σημαντική φαινοτυπική ετερογένεια. Ασθενείς οι οποίοι εμφάνιζαν βαρύτερα συμπτώματα από ότι αναμενόταν με βάση το γενότυπό τους (ήπια με βαριά μετάλλαξη, ή συνδυασμός δύο ήπιων μεταλλάξεων) έφεραν πολυμορφισμούς σε κατάσταση cis με τις ήπιες μεταλλάξεις, σε συγκεκριμένες ρυθμιστικές του γονιδίου επηρεάζοντας πιθανόν αρνητικά το ρυθμό της μεταγραφής ή ακόμα και τη διαδικασία ωρίμανσης του πρόδρομου mRNA. Από την μελέτη συνολικά του γενότυπου με τον κλινικό φαινότυπο και στους 83 ασθενείς στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε μόνο για το είδος των μικροοργανισμών που αναπτύσσονταν στις καλλιέργειες των πτυέλων. Επίσης στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε και στα επίπεδα των ηλεκτρολυτών στον ιδρώτα. Διερευνήθηκε επίσης η πιθανή τροποποιητική δράση των γονιδίων PRSS1 και PSTI, τα οποία συνδέονται με την εμφάνιση της ιδιοπαθούς χρόνιας παγκρεατίτιδας. Προέκυψε ότι ένας ασθενής με γενότυπο ΔF508/ΔF508 ήταν ομόζυγος ταυτόχρονα και για τη μετάλλαξη A16V στο γονίδιο PRSS1. Η ύπαρξη της συγκεκριμένης μετάλλαξης σε ένα μόνο ασθενή, μπορεί να αποτελεί απλά ένα τυχαίο γεγονός, ή αντίθετα μπορεί να αποτελεί μια σοβαρή ένδειξη της συνεισφοράς κάποιων τροποποιητικών γονιδίων στον φαινότυπο ασθενών με κυστική ίνωση.