Κατασκευή βιοαισθητήρων που στηρίζονται σε λιπιδικές μεμβράνες με συνθετικούς υποδοχείς για την ανίχνευση τοξικών ουσιών σε τρόφιμα, νερ...

Abstract

The Ph.D. thesis involved the study, design of optical and electrochemical bilayer lipid membranebased biosensors for compounds of biomedical, environmental and industrial interest. The present work reports a technique for the construction of portable devices that are based on stabilized lipid membrane with an incorporated artificial receptor (i.e., hydroxy or permethoxy calixarene derivative) that can be used for the rapid optical detection of doping materials in human urine. The artificial receptors are incorporated within the lipid mixture prior to polymerization. The polymerization process takes place by using UV irradiation instead of heating at 60 oC. Microporous filters composed off glass fibers were used as supports for the stabilization of these sensors. The lipid film was formed on the filter by polymerization, using UV irradiation prior to its use. Methacrylic acid was the functional monomer, ethylene glycol dimethacrylate was the crosslinker and 2, 2’- azobis-(2-methylpropionitrile) was the initiator. The polymerization is completed within 4 h and the artificial receptors retain their activity. These devices provided a simple screening sensitive spot optical test for the rapid one-shot detection of dopamine and ephedrine (using the hydroxy and permethoxy receptors, respectively, in the lipid films during polymerisation) in human urine. The lipid films without the receptors provided fluorescence under a UV lamp. The use of the receptors in these films quenched this fluorescence and the color became similar to that of the filters without the lipid films. A drop of urine containing dopamine or ephedrine provided a ''switching on'' of the 110 flourescence which allows the rapid detection of these stimulants in human urine at the levels of 10-9 M concentrations. The technique is now based on a calibration graph and therefore as a quantitative method for the detection of dopamine or ephedrine in real samples of urine is provided herein that can be complimentary to HPLC methods. The mechanism of signal generation was investigated in the present paper by using differential scanning calorimetric (DSC) measurements. The construction of these devices allows the practical use of the techniques for chemical sensing, based on lipid membranes to prepare portable devices for the optical detection of toxicants in environmental, clinical samples or foods in the field, and further commercialization of these devices. The present technique describes the preparation of a selective receptor for carbofuran and the development of a simple sensitive spot optical test for the rapid one-shot detection of carbofuran using stabilized lipid films supported on a methacrylate polymer on a glass fiber filter with incorporated artificial receptor. The selective receptor was synthesized by a chemical reaction using a resorcin[4]arene receptor by transforming all the –OH groups into phosphoryl groups. The lipid films without this receptor provided fluorescence under a UV lamp. The use of the receptor in these films quenched this fluorescence and the colour became similar to that of the filters without the lipid films. A drop of aqueous solution of carbofuran provided a “switching on” of the fluorescence which allows the rapid detection of this stimulant at the levels of 10-9 M concentrations. The effect of potent interferences included a wide range of compounds. The results showed no interferences from these compounds in concentration levels usually found in real samples. The effect of interference of proteins and lipids was also examined. The reproducibility of the method was checked in about 100 samples and all of them were found to provide similar results. The device was tested/ evaluated in real samples of fruits, vegetables and dairy products. Note that the colours of the filters remain stable for periods of more than two months.The present paper describes a technique for the rapid, selective and sensitive electrochemical flow injection analysis (FIA) of carbofuran in foods using stabilized after storage in air lipid membranes in which the receptor was incorporated. Injections of carbofuran followed into flowing streams of a carrier electrolyte solution. A complex formation between the calix[4]arene receptor and carbofuran takes place through hydrogen bonding [the benzene group of carbamate to be intercalated within the 111 cavity of the receptor molecule] that enhances the preconcentration of carbofuran at the lipid membrane surface which in turn causes dynamic alterations of the electrostatic fields and phase structure of membranes; as a result ion current transients were obtained and the magnitude of these signals was correlated to carbofuran concentration, which could be determined at the nanomolar level. The response times were ca. 1 min. The investigation of the effect of potent interferences included a wide range of compounds usually found in foods and also proteins and lipids. The present method now provides a technique for the rapid detection of carbofuran at the levels of nM concentrations without interferences from the other constituents and can be used as complimentary rapid technique to HPLC methods. The present paper describes the use of a phosphoryl derivative of a resorcin[4]arene receptor for the development of a chemosensor for the rapid, selective and sensitive electrochemical flow injection analysis (FIA) of zinc in natural tap, synthesized and mineral water, without any laborious and time-consuming treatment; the sensor is based on stabilized after storage in air lipid membranes in which the receptor was incorporated. The device can sense an analyte in a drop (50-100 μL) of sample. Injections of zinc were made into flowing streams of a carrier electrolyte solution. A complex formation between the calix[4]arene receptor and zinc takes place that enhances the preconcentration of zinc at the lipid membrane surface which in turn causes dynamic alterations of the electrostatic fields and phase structure of membranes; as a result ion current transients were obtained and the magnitude of these signals was correlated to zinc concentration, which could be determined at the nanomolar level. The response times were ca. 5 sec. The investigation of the effect of potent interferences included other metals and compounds usually found in real samples of waters

Η διδακτοδική διατριβή ασχολήθηκε με την μελέτη, σχεδίαση και κατασκευή οπτικών και ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων διστρωματικών λιπιδικών μεμβρανών, με σκοπό τον προσδιορισμό ουσιών βιοχημικού, περιβαλλοντικού και βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Η κατασκευή των φορητών συσκευών βασίζεται σε σταθεροποιημένες λιπιδικές μεμβράνες με ενσωματωμένο ένα τεχνητό υποδοχέα και η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον οπτικό προσδιορισμό ουσιών της ντοπαμίνης και της εφεδρίνης στα ανθρώπινα ούρα. Οι τεχνητοί αυτοί υποδοχείς ενσωματώνονται στη λιπιδική μεμβράνη πριν τον πολυμερισμό. Φίλτρα υαλονημάτων με μικροπόρους χρησιμοποιήθηκαν για την σταθεροποίηση των συγκεκριμένων βιοαισθητήρων. Η λιπιδική μεμβράνη σχηματίστηκε πάνω στο φίλτρο με πολυμερισμό με την χρήση UV ακτινοβολίας και θερμικά. Το μεθακρυλικό οξύ ήταν το μονομερές, η διμεθακρυλική αιθυλενογλυκόλη ήταν διαδικτυωτής και το 2,2΄-αζωδιΐσοβουτυρονιτρίλιο ήταν εκκινητής. Ο πολυμερισμός ολοκληρώνεται σε 4 ώρες και οι τεχνητός υποδοχέας διατηρεί την δραστικότητά του για τουλάχιστον δύο μήνες. Οι συσκευές αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορητοί ανιχνευτές επειδή διαθέτουν ένα απλό ευαίσθητο σημείο οπτικής ανίχνευσης για την γρήγορη και επί τόπου ανίχνευση ντοπαμίνης και εφεδρίνης στα ανθρώπινα ούρα. Επιπλέον είναι δυνατόν να έχουμε ποσοτικό προσδιορισμό αν χρησιμοποιηθεί το διάγραμμα βαθμονόμησης.Η μέθοδος αυτή για την ανίχνευση ντοπαμίνης και εφεδρίνης σε δείγματα ανθρώπινων ούρων, μπορεί να είναι συμπληρωματική στις HPLC μεθόδους,. Επίσης σε αυτή την διδακτορική διατριβή παρουσιάζεται ο μηχανισμός παραγωγής σήματος ΄΄switch on΄΄ και ΄΄switch off΄΄ του φθορίζοντος σήματος. Επίσης περιγράφεται η προετοιμασία ενός εκλεκτικού υποδοχέα για το carbofuran και η ανάπτυξη ενός απλου οπτικού test, για την ταχεία ανίχνευση του, χρησιμοποιώντας σταθεροποιημενες λιπιδικές 107 μεμβράνες, υποστηριζόμενες πάνω σε ένα μεθακρυλικό πολυμερές, πάνω σε φίλτρο υαλονημάτων με ενσωματωμένο τον τεχνητό υποδοχέα. Ο εκλεκτικός υποδοχέας εχει συντεθεί από μια χημική αντίδραση χρησιμοποιώντας το resorcin[4]arene υποδοχέα με μετατροπή όλων των –ΟΗ ομάδων σε διαίθυλ-φωσφατιδικές ομάδες. Οι λιπιδικές αυτές μεμβράνες χωρίς τον υποδοχέα παρουσιάζουν φθορισμό κάτω από μια UV λάμπα. Η ενσωμάτωση του υποδοχέα σε αυτές τις μεμβράνες εξαφάνισε τον φθορισμό. Μια σταγόνα υδατικού διαλύματος carbofuran έχει ως αποτέλεσμα την επανεμφάνιση του φθορισμού, επιτρέποντας την γρήγορη ανίχνευση του σε επίπεδα συγκεντρώσεων των 10-9 M. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα τυχόν παρεμποδιστικής δράσης από διάφορες ουσίες που υπάρχουν μέσα στα τρόφιμα. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν ακαμία παρεμπόδιση από αυτά τα συστατικά στα επίπεδα συγκέντρωσης που εντοπίζονται συνήθως σε αληθινά δείγματα. Επίσης εξετάστηκε η παρεμποδιστική δράση των πρωτεινών και των λιπιδίων. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου ελέγχτηκε σε περίπου 100 δείγματα και όλα από αυτά βρέθηκαν να δίνουν παρόμοιο αποτέλεσμα. Η συσκευή ελέγχτηκε/αποτιμήθηκε σε αληθινά δείγματα φρούτων, λαχανικών και γαλακτοκομικών προιόντων. Ας σημειωθεί ότι τα χρώματα των φίλτρων παρέμεναν σταθερά για περιόδους μεγαλύτερες των δύο μηνών. Επίσης ο εκλεκτικός υποδοχέας του carbofuran χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη μιας μεθόδου με σκοπό τον γρήγορο ηλεκτροχημικό προσδιορισμό του carbofuran σε τρόφιμα, χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένες με πολυμερισμό λιπιδικές μεμβράνες, με ενσωματωμένο το φωσφορυλιωμένο-παράγωγο του resorcin[4]arene υποδοχέα. Εκχύσεις carbofuran έγιναν σε συνεχή ροή φέροντος ηλεκτρολυτικού διαλύματος. Ένας σύνθετος σχηματισμός λαμβάνει χώρα μεταξύ του calix[4]arene και του carbofuran μέσω δεσμών υδρογόνου [ο βενζολικός δακτύλιος των καρβαμιδικών παρεμβάλλεται εντός των μορίων του υποδοχέα] και ο οποίος αυξάνει την προσυγκέντρωση του carbofuran στην επιφάνεια της λιπιδικής μεμβράνης, το φαινόμενο αυτό προκαλεί αλλαγές στην δομή της φάσης της λιπιδικής μεμβράνης. Ως αποτέλεσμα, ελήφθησαν στιγμιαία σήματα ρεύματος, διάρκειας δευτερολέπτων, με χρόνους απόκρισης περίπου ένα λεπτό, μετά την έκθεση των λιπιδικών μεμβρανών στην ουσία.Το μέγεθος των σημάτων είναι ευθέως ανάλογο της συγκέντρωσης του συστατικού και του οποίου το όριο προσδιορισμού είναι της τάξεως των nM Η επίδραση παρεμποδιστικών ουσιών, συμπεριλαμβανομένου ενός μεγάλου φάσματος ενώσεων που βρίσκονται συνήθως στα τρόφιμα, εξετάστηκε καθώς επίσης και η επίδραση πρωτεϊνών και λιπιδίων. Η παρούσα μέθοδος περιγράφει μία τεχνική για την γρήγορη ανίχνευση του carbofuran σε επίπεδα συγκεντρώσεων της τάξης των nM, χωρίς παρεμποδίσεις από άλλα συστατικά και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν μία ανταγωνιστική των HPLC μεθόδων. Επίσης αναπτύχθηκε μια τεχνική για την κατασκευή ενός αισθητήρα για την γρήγορη, εκλεκτική ανίχνευση του ψευδαργύρου σε νερό βρύσης, συνθετικά νερά και μεταλλικό νερό με την αναλυτική μέθοδο FIA (flow injection analysis), χωρίς να απαιτείται καμία εργαστηριακή και χρονοβόρα 108 προκατεργασία του δείγματος.Ο αισθητήρας βασίζεται σε σταθεροποιημένες στον αέρα λιπιδικές μεμβράνες όπου το φωσφωρυλιωμένο παράγωγο του υποδοχέα είναι ενσωματωμένο στην δομή της μεμβράνης. Η συσκευή μπορεί να ανιχνεύσει τον αναλυτή με μια σταγόνα (50-100 μL) του δείγματος. Ενέσεις διαλύματος ψευδαργύρου έγιναν σε ροή φέροντος ηλεκτρολυτικού διαλύματος. Ένας σύνθετος σχηματισμός μεταξύ του calix[4]arene υποδοχέα και του ψευδαργύρου λαμβάνει χώρα που αυξάνει την προσυγκέντρωση του ψευδαργύρου στην επιφάνεια της λιπιδικής μεμβράνης και η οποία με τη σειρά της δημιουργεί δυναμικές αλλαγές στα ηλεκτροστατικά πεδία και στην δομή της φάσης των μεμβράνων. Σαν αποτέλεσμα παροδικά ιοντικά ρεύματα παρατηρήθηκαν και το μέγεθος αυτών των σημάτων σχετίζεται με την συγκέντρωση του ψευδαργύρου. Ο χρόνος απόκρισης ήταν περίπου 5 sec. Εξετάστηκε τέλος η παρεμποδιστική δράση διαφόρων συστατικών συμπεριλαμβανομένων και άλλων μετάλλων που μπορεί να υπάρχουν σε δείγματα νερού