Γενετική ανάλυση της αγγειογένεσης στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο: γονιδιακοί πολυμορφισμοί σε ειδικά μόρια του ενδοθηλίου και η συμβολή τους στη μελέτη της ενδοθηλιακής βιολογίας και της αγγειογένεσης

Abstract

The immune system has evolved to protect the body from foreign invading pathogens. Unfortunately under certain conditions the immune tolerance is lost and the immune system attacks the host causing damage in several tissues and organs, situation that is observed in various autoimmune diseases. Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is the prototype autoimmune disorder that is principally characterized by hyper activated B-cells, autoantibodies production and aberrant activation of the immune system leading to chronic inflammation. Among the various systems affected in SLE is the vascular system and cardiovascular disorders account for increased morbidity and mortality during the course of the disease. SLE patients are characterized by accelerated and premature atherosclerosis that can’t be fully explained by the traditional Framingham risk factors. Several non-traditional risk factors have been proposed such as systemic inflammation that impairs endothelial cell function and autoantibodies against endothelial cell constituents that cause damage and cell death. Further attack of the cellular immunity to endothelial cells and inappropriate endothelial repair leads ultimately in endothelial dysfunction that can be recognized both with clinical methods and biological-cellular markers such as the increased number of CECs and decreased EPCs numbers in the blood of SLE patients. Atherosclerosis is now considered as an inflammatory and autoimmune disease. Many constituents of both innate and adaptive immunity have been recognized in atherosclerotic plaques and may account for the pathogenesis of the disease. The initiating event is the endothelial dysfunction followed by endothelial layer denudation and further progression due to aberrant angiogenesis that takes place inside the evolving plaque. Although several mechanisms have been proposed, the exact nature of excessive vasculopathy in SLE remains elusive. Signaling pathways in endothelial cells that can be activated or influenced by the immune system may be excellent candidates for further studies. CD40 is expressed in several cell types including Β-lymphocytes, monocytes/macrophages and endothelial cells and is considered of outmost importance for efficient humoral immune responses. On the other hand CD40 signalling exerts proinflammatory functions in endothelial cells and monocytes, accelerates atherosclerosis and induces aberrant angiogenic responses due to inappropriate production of VEGF. Although CD40 has recently been identified in a genome-wide association study as a novel rheumatoid arthritis susceptibility gene such an association has not been documented for SLE. Nevertheless, sustained CD40L expression by T cells and platelets in SLE activates a variety of cells via its receptor CD40 contributing to disease pathogenesis and increased levels of CD40L have been documented in plasma of SLE patients. VEGF is considered to be the principal angiogenic growth factor that mediates signals for endothelial cell proliferation and viability and induces endothelial cell migration and sprouting, thus contributing to efficient angiogenesis. VEGF is produced by endothelial cells, monocytes, fibroblasts and SMCs in response to hypoxia which is the major physiological signal for angiogenesis. However, under certain pathological conditions, VEGF can be produced by other cell types such as tumor cells or activated T-lymphocytes inducing inflammatory angiogenesis, known as neo-angiogenesis. Neo-vessels are immature vessels, with no or little mural cells, fragile and leaky. Such vessels are abundant in atherosclerotic plaques and are considered as one of the major factors for intraplaque hemorrhage and instability leading to vulnerable atherosclerotic plaques. VEGFR2 is the principal receptor that mediates VEGF signals in endothelial cells and belongs to the receptor-tyrosine kinases superfamily. The extracellular region of the receptor is composed of 7 Ig-like domains with the ligand binding region located on the 2nd-3d Ig-like domains. The 4th-7th Ig-like extracellular domains are considered crucial for signal transduction. Upon ligand binding, the receptor dimerizes and autophosphorylated transmitting signals to other intracellular kinases. VEGFR2 has been associated with vascular diseases such as coronary artery disease and genetic alterations that influence its signaling have been found in certain vascular tumors but its implication in SLE has not been investigated. Taken together, the endothelial expression of both CD40 and VEGFR2, their ascribed role in immune regulation and endothelial function and the possible cross-talk between their signaling cascades sought us to explore possible associations of SNPs in these two molecules with SLE thus implicating them in disease pathogenesis. For genetic association study, the primary sample set consisted of 351 SLE patients and 670 matched healthy controls of Greek origin. We used 158 SLE patients and 155 controls from Turkey as replication sample. Genotyping of rs4810485 (that has been associated with rheumatoid arthritis) was performed by RFLPs and the Sequenom MassArray technology. The expression of CD40 mRNA and protein was assessed in unstimulated and LPS-stimulated peripheral blood mononuclear cells by quantitative real time PCR and flow cytometry, respectively. CD45 negative cells were isolated from peripheral blood and the expression of CD40 in CECs subfraction of these cells was also assessed by flow-cytometry. The V297I (rs2305948) and Q472H (rs1870377) single nucleotide polymorphisms (SNPs) in VEGFR2 located in third and fifth extracellular IgM-like domains were genotyped with Taqman technology and RFLPs in 150 SLE patients and 96 healthy controls. CECs were isolated from whole blood from 54 SLE patients with CD146-coated magnetic beads and enumerated after staining with TRITC-labeled Ulex Europaeus Aglutinin-1 according to standard protocols. Modeling of the mutation V297I was based on the 3D structure of domains D2 and D3 of VEGFR2 in complex with VEGF-C. Sequence alignment of the D5 domain of VEGFR2 was performed on the KIT sequence, followed by homology modeling on the KIT ectodomain structure to investigate mutation Q472H. The minor allele T of CD40 rs4810485 SNP was significantly under-represented in Greek SLE patients compared to healthy controls. The association was replicated in the Turkish cohort and remained statistically significant after the meta-analysis of 509 SLE patients and 825 healthy controls. In both cases and controls, the rs4810485 G/T and T/T genotypes were associated with significantly reduced CD40 mRNA and protein expression in peripheral blood CD14+ monocytes and CD19+ B cells compared to G/G genotype, both under basal conditions and following antigen stimulation. G/T and T/T genotypes were also associated with reduced numbers of total and CD40+ CECs and reduced fluorescence intensity of CD40 on CD40+ CECs. The risk allele A of the VEGFR2 rs1870377 SNP was more frequent in individuals with SLE than in healthy controls, while A/A genotype appeared to be a SLE risk factor. No association was detected between rs2305948 and SLE. Within the rs1870377 A/A genotype the number of CECs was significantly higher than that of T/T genotype. Modeling revealed that amino acid position #472 which is located on the D3 D5 Ig-like domain of the extracellular region of VEGFR2 affects the efficiency of trans-autophosphorylation and possibly the receptor activation and cell signaling. In conclusion we have identified CD40 as a novel susceptibility locus in Greek and Turkish SLE patients. The rs4810485 minor allele T is under-represented in SLE and correlates with reduced CD40 expression in peripheral blood monocytes, B cells and endothelial cells. This fact indicates that majority of SLE patients is characterized by higher CD40 expressions both in immune and endothelial cells and higher numbers of CECs indicative of increased vascular damage. These findings may account for increased CD40 signaling in immune and endothelial cells and may have implications both in the regulation of aberrant immune responses and increased endothelial cell activation and damage due to increased CD40 signaling. The VEGFR2 Q472H polymorphism is associated with increased susceptibility to SLE, thus implicating VEGFR2 in pathogenesis of the disease. The risk genotype for rs1870377 SNP was associated with higher CECs numbers, indicating that this mutation may correlate with increased endothelial damage. Structural data suggest that this mutation may cause impairment in cell signaling, thus contributing to SLE pathogenesis. Our overall findings identified CD40 and VEGFR2 genes as candidates in SLE pathogenesis and provide evidence to support the hypothesis that their pathways may implicated in endothelial biology and angiogenesis in SLE. It’s intriguing to speculate that in addition to aberrant immune responses, CD40 signaling in B-cells and monocytes mediates aberrant autoantibody production and endothelial cell damage along with the overproduction of VEGF. Increased VEGF binding to VEGFR2 that transmits impaired signals may further compromise endothelial integrity. This mechanism can serve as working hypothesis that of course needs prove experimental validation in order to be proved.

Το ανοσοποιητικό σύστημα εξελίχθηκε για να προστατεύει το σώμα από ξένα εισβάλλοντα παθογόνα. Κάτω όμως από συγκεκριμένες παθολογικές καταστάσεις η ανοσολογική ανοχή χάνεται και το ανοσοποιητικό σύστημα επιτίθεται στον «εαυτό» προκαλώντας βλάβη σε διάφορους ιστούς και όργανα, κατάσταση η οποία χαρακτηρίζει την αυτοανοσία. Ο Σ υστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (Σ.Ε.Λ.) αποτελεί το πρωτότυπο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται κυρίως από υπερενεργοποιημένα Β-λεμφοκύτταρα, παραγωγή αυτοαντισωμάτων και απρόσφορη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος οδηγώντας σε χρόνια φλεγμονή. Μεταξύ των διαφόρων συστημάτων που προσβάλλονται στο Σ.Ε.Λ. είναι το αγγειακό σύστημα και οι καρδιαγγειακές διαταραχές αποτελούν μείζονα αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας κατά τη διαδρομή της νόσου. Οι ασθενείς με Σ.Ε.Λ. χαρακτηρίζονται από πρώιμη και επιταχυνόμενη αθηροσκλήρωση που δεν ερμηνεύεται πλήρως από τους παραδοσιακούς παράγοντες κινδύνου κατά Framingham. Για το λόγο αυτό έχουν προταθεί διάφοροι, μη παραδοσιακοί, παράγοντες κινδύνου όπως η συστηματική φλεγμονή, η παραγωγή αντι-ενδοθηλιακών αυτοαντισωμάτων, επίθεση στο ενδοθήλιο από αυτοδραστικά Τ-λεμφοκύτταρα και ανισορροπία μεταξύ ενδοθηλιακής βλάβης και επιδιόρθωσης που οδηγούν τελικά σε ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που μπορεί να αναγνωριστεί τόσο κλινικά όσο και βιολογικά με τη χρήση κυτταρικών δεικτών όπως ο αυξημένος αριθμός κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών κυττάρων (CECs) και ο μειωμένος αριθμός ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (EPCs) στο αίμα ασθενών με Σ.Ε.Λ. Η αθηροσκλήρωση σήμερα θεωρείται ως φλεγμονώδης και αυτοάνοση νόσος με συμμετοχή της φυσικής και της επίκτητης ανοσίας. Το εναρκτήριο γεγονός στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης είναι η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που ακολουθείται από κινητοποίηση φλεγμονωδών και ανοσολογικών μηχανισμών και περαιτέρω επέκταση οφειλόμενη σε φλεγμονώδη νεοαγγειογένεση. Αν και ποικίλοι μηχανισμοί έχουν προταθεί, η ακριβής αιτιολογία της εκτεταμμένης αγγειοπάθειας στο Σ.Ε.Λ. παραμένει αδιευκρίνιστη. Σηματοδοτικά μονοπάτια στα ενδοθηλιακά κύτταρα που ενεργοποιούνται ή επηρεάζονται από τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος αποτελούν εξαιρετικές υποψηφιότητες. Το συνδιεγερτικό μόριο CD40 εκφράζεται σε διάφορους κυτταρικούς πληθυσμούς όπως τα Β- λεμφοκύτταρα, τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η σηματοδότηση του μορίου μετά την πρόσδεση του συνδέτη του, του CD154 (CD40L), στα ανοσοποιητικά κύτταρα απαιτείται για την ανάπτυξη αποτελεσματικής χυμικής αλλά και κυτταρικής ανοσίας ενώ στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μονοκύτταρα επάγει προφλεγμονώδη φαινόμενα, επιταχύνει την ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης και κινητοποιεί απρόσφορες αγγειογενείς αποκρίσεις λόγω της υπερπαραγωγής αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF). Η συμμετοχή του γονιδίου CD40 στο Σ.Ε.Λ. δεν έχει επιβεβαιωθεί, ωστόσο η εμμένουσα έκφραση του CD40L από Τ-λεμφοκύτταρα και αιμοπετάλια και αυξημένα επίπεδα διαλυτού CD40L στο πλάσμα ασθενών με Σ.Ε.Λ, μπορεί να ενεργοποιήσει πολυάριθμα κύτταρα. Ο VEGFR2 εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μεταβιβάζει τα βασικότερα προαγγειογενετικά σήματα και ρυθμίζει τις βασικές βιολογικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η δράση του επιτυγχάνεται μετά από πρόσδεση του συνδέτη του, του VEGF, ο οποίος παράγεται από ενδοθηλιακά κύτταρα, μονοκύτταρα, ινοβλάστες και λεία μυϊκά κύτταρα ως απόκριση στην υποξία που αποτελεί το κύριο φυσιολογικό σήμα για την έναρξη της αγγειογένεσης. Κάτω από παθολογικές καταστάσεις όπως για παράδειγμα η χρόνια φλεγμονή, ο VEGF παράγεται και από άλλους τύπους κυττάρων όπως τα νεοπλασματικά κύτταρα και τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα και επάγει φλεγμονώδη νεοαγγειογένεση ρυθμίζοντας τον υποδοχέα VEGFR-2 με ένα μηχανισμό θετικής επανατροφοδότησης οδηγώντας στην υπερέκφραση του. Νεοαγγειογένεση παρατηρείται στις εκτεταμένες αθηροσκληρωτικές πλάκες και θεωρείται υπεύθυνη για τις αιμορραγίες εντός της πλάκας, την αστάθεια και τελικά τη ρήξη τους. Ο VEGFR2 έχει συσχετισθεί με αγγειακές νόσους όπως η στεφανιαία νόσος και γενετικές μεταλλάξεις του έχουν βρεθεί σε αγγειακούς όγκους αλλά παραμένει άγνωστη η πιθανή συσχέτιση του με το Σ.Ε.Λ. Λαμβάνοντας υπόψη την ενδοθηλιακή έκφραση του CD40 και του VEGFR2, τον περιγεγραμμένο ρόλο τους στις άνοσες αποκρίσεις και την ενδοθηλιακή βιολογία και την πιθανή διασταυρούμενη αλληλεπίδραση των μονοπατιών τους, διερευνήσαμε γενετικά μέσω πολυμορφισμών την πιθανή συμμετοχή των γονιδίων στην παθογένεια του Σ.Ε.Λ. Για τις μελέτες γενετικής συσχέτισης, το πρωτογενές δείγμα αποτελούνταν από 351 ασθενείς με Σ.Ε.Λ. και 670 υγιείς μάρτυρες, όλοι Ελληνικής καταγωγής. Χρησιμοποιήθηκαν 158 ασθενείς με Σ.Ε.Λ. και 155 υγιείς μάρτυρες από την Τουρκία ως δείγμα επαλήθευσης. Η γονοτύπηση για τον rs4810485 μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (που έχει ήδη συσχετιστεί με ρευματοειδή αρθρίτιδα) πραγματοποιήθηκε με RFLPs και την τεχνολογία Sequenom MassArray. Η έκφραση του CD40 mRNA και πρωτεΐνης εκτιμήθηκε σε βασικές συνθήκες και μετά από αντιγονική διέγερση με LPS σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος με ποσοτική Real-Time PCR και κυτταρομετρία ροής. Τα CD45 αρνητικά κύτταρα απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα και ο συνολικός αριθμός της υποομάδας των CECs καθώς και η έκφραση του CD40 σε αυτά εκτιμήθηκε επίσης με κυτταρομετρία ροής. Οι V297I (rs2305948) και Q472H (rs1870377) μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στο VEGFR2 γονοτυπήθηκαν με τεχνολογία Taqman και RFLPs σε 150 ασθενείς με Σ.Ε.Λ. και 96 υγιείς μάρτυρες. Τα CECs απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα με αντι-CD146 σημασμένα μαγνητικά σφαιρίδια και μετρήθηκαν μετά από χρώση τους με TRITC-σημασμένη Ulex Europaeus Aglutinin-1 σύμφωνα με το δημοσιευμένο πρωτόκολλο συμφωνίας. Η απεικόνιση του V297I βασίστηκε στο τρισδιάστατη δομή των D2 και D3 δομικών περιοχών του VEGFR-2 σε σύμπλοκο με τον VEGF-C. Η αντιστοίχιση της αλληλουχίας της D5 περιοχής του VEGFR2 πραγματοποιήθηκε με την αλληλουχία του c-KIT (επίσης υποδοχέας κινάσης τυροσίνης) ακολουθούμενη από ανάλυση ομολογίας της εξωκυττάριας περιοχής του ΚΙΤ, προκειμένου να διερευνηθεί ο πολυμορφισμός Q472H. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το έλασσον αλληλόμορφο Τ του rs4810485 μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού στο CD40 υποαντιπροσωπεύεται σημαντικά στους Έλληνες ασθενείς με Σ.Ε.Λ. συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες. Η συσχέτιση επαληθεύτηκε στην Τουρκική ομάδα μελέτης και παρέμεινε ισχυρή στη μεταανάλυση 509 ασθενών με Σ.Ε.Λ. και 825 υγιών μαρτύρων. Τόσο σε ασθενείς όσο και σε μάρτυρες, οι rs4810485 G/T και T/T γονότυποι σχετίζονταν με σημαντικά χαμηλότερη έκφραση του CD40 σε επίπεδο RNA και πρωτεΐνης στα B-λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα τόσο σε βασικές συνθήκες όσο και μετά από αντιγονική διέγερση σε σχέση με το G/G γονότυπο. Οι G/T και T/T γονότυποι σχετίζονταν επίσης με σημαντικά χαμηλότερο συνολικό αριθμό αλλά και CD40+ CECs αλλά και χαμηλότερη επιφανειακή έκφραση του CD40 συγκριτικά με το G/G γονότυπο. Το έλασσον αλληλόμορφο Α του VEGFR2 rs18703077 πολυμορφισμού ήταν σημαντικά συχνότερο στους ασθενείς με Σ.Ε.Λ. σε σχέση με τους μάρτυρες ενώ και η παρουσία του ομόζυγου γονοτύπου A/A ήταν επίσης σημαντικά συχνότερη στους ασθενείς. Δεν ανιχνεύθηκε συσχέτιση με το Σ.Ε.Λ. για τον πολυμορφισμό rs2305948. Μεταξύ των ασθενών με τον A/A γονότυπο, ο αριθμός CECs ήταν σημαντικά υψηλότερος σε σχέση με τον Τ/Τ γονότυπο. Η απεικόνιση της μεταλλαγής έδειξε ότι η θέση 472 που βρίσκεται στην 5η Ig-like περιοχή του εξωκυττάριου τμήματος του VEGFR2 και επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της trans- αυτοφωσφορυλίωσης του υποδοχέα και πιθανά την ενεργοποίηση του. Τα αποτελέσματα καθιστούν το CD40 ως γενετικό παράγοντα κινδύνου για Σ.Ε.Λ. Το έλασσον αλληλόμορφο Τ του rs4810485 που υποαντιπροσωπεύεται στο Σ.Ε.Λ. συσχετιζόταν με χαμηλότερη έκφραση CD40 στα Β-λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι μία μεγάλη υποομάδα των ασθενών που φέρουν το αλληλόμορφο G, χαρακτηρίζεται από υψηλότερες εκφράσεις CD40 τόσο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς επίσης και από αυξημένο αριθμό CECs στο αίμα, ενδεικτικό ενδοθηλιακής βλάβης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι στους ασθενείς αυτούς η σηματοδότηση του CD40 μπορεί να είναι ενισχυμένη στα κύτταρα στόχους και μπορεί να έχει συνέπειες τόσο στην απρόσφορη ανοσορύθμιση αλλά και στην ενδοθηλιακή λειτουργία προκαλώντας βλάβη είτε άμεσα μέσω της σηματοδότησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα είτε έμμεσα μέσω της ενίσχυσης των αντι-ενδοθηλιακών άνοσων αποκρίσεων. Ο πολυμορφισμός Q472H και η ισχυρή συσχέτιση του με το Σ.Ε.Λ. καθιστά το μόριο ως υποψήφιο για τη συμμετοχή του στην παθογένεια της νόσου. Η περαιτέρω ανάλυση του αριθμού των CECs υποδηλώνει ότι ο υπεραντιπροσωπευόμενος A/A γονότυπος μπορεί να σχετίζεται άμεσα με ενδοθηλιακή βλάβη ενώ τα δομικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι, ανεξαρτήτως συσχέτισης με το νόσημα, και οι δύο πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν μπορεί να προκαλούν ενδοθηλιακή βλάβη λόγω διαταραχών στη σηματοδότηση του μορίου. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας εμπλέκουν το CD40 και το VEGFR2 στην παθογένεια του Σ.Ε.Λ. και παρέχουν περαιτέρω προεκτάσεις που μπορεί να αφορούν και την ενδοθηλιακή βιολογία και αγγειογένεση. Μία πολύ ελκυστική εικασία με βάση τα αποτελέσματα και τη βιβλιογραφικά βασιζόμενη ερμηνεία τους είναι ότι επιπρόσθετα των διαταραχών στην ασοσοπαθογένεια του Σ.Ε.Λ., η σηματοδότηση του CD40 στα Β- λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα μπορεί να προκαλέσει και εκτεταμένη ενδοθηλιακή βλάβη λόγω υπερπαραγωγής αντι-ενδοθηλιακών αντισωμάτων και υπερενεργοποίησης των μονοκυττάρων με αύξηση της προσκόλλησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα και υπερπαραγωγή VEGF. O αυξημένος VEGF προσδενόμενος σε ένα υποδοχέα με πιθανά διαταραγμένη σηματοδότηση, μπορεί περαιτέρω να επηρεάσει την ενδοθηλιακή ακεραιότητα. Ο καθαρά υποθετικός αυτός μηχανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως «υπόθεση εργασίας» που πρέπει να ελεγχθεί πειραματικά.