Διερεύνηση κυτταρικών παραμέτρων σε ιστούς του μυδιού Mytilus galloprovincialis για τη βιοπαρακολούθηση της ρύπανσης παράκτιων οικοσυστημάτων και τ...

Abstract

The current dissertation concerns the investigation of cellular and biochemical pollution biomarkers in tissues of mussels Mytilus galloprovincialis by integrating their responses into an ecological quality index («Health Status Index/HIS», «Lysosomal Response Index/LRI», «Integrated Biomarker Response/IBR» and «Tentative Marine Pollution Index» proposed by this dissertation) for assessment of pollution in marine ecosystems. The examination of the seasonal variations of biomarkers, the interaction of heavy metals, the response of different in size mussels in certain lysosomal parameters and the histochemical localization of three lysosomal enzymes waw fulfilled in order to provide information which should be used in biomonitoring studies for the better estimation of pollution in coastal ecosystems. Mussels were collected from Thermaikos and Strymonikos gulf in summer and autumn 2004 and in spring 2005. Mussels were exposed to organic pollutants and two established biomarkers («lysosomal membrane stability/LMS» and «neutral red retention assay/NRR») and three under investigation biomarkers («morphometrical alterations of neutral lipids (NL)», «micronucleus frequency/MN and other nuclear abnormalities» and «morphometrical alterations of lysosomes/LYS») were applied in the digestive gland and the hemolymph. Mussels were experimentally exposed to Cu, Hg, and a mixture of Cu and Hg and followed by a detoxification period of seven days under laboratory conditions. Additionally, mussels were collected from Halastra on June and December 2009 and histochemistry of lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β-glucuronidase was applied in the digestive gland cryosections. Finally, different in size mussels (small and large mussels) were collected from Halastra on June 2010 and lysosomal parameters such as «LMS», «LYS», «LRI», «structural changes in the digestive tubule epithelium» and histochemistry of the lysosomal enzymes N-acetyl-β-hexozaminidase, acid phosphatase and β-glucuronidase were examined in their digestive gland. The results supported the use of «HIS» and «LRI» as powerful tools for the qualitative and quantitative evaluation of environmental stress, while enhanced the use of «IBR» as a constructive method for the qualitative discrimination of contaminated sites. The «Tentative Marine Pollution Index» was introduced providing encouraging results for its use as a tool for the evaluation of water quality along hellenic coastal environments. The cellular and biochemical biomarkers, with the exception of biomarker «NRR», showed strong seasonal variations and it was enhanced the aspect that the middle of summer is suitable period for sampling in biomonitoring studies dealing with lysosomal parameters in mussels. The «morphometrical alterations of neutral lipids, lysosomes and lipofuscin», as well as the «structural changes in the digestive tubule epithelium» were supported as powerful biomarkers in biomonitoring studies of marine pollution. It was demonstrated for the first time the antagonistic effect of Cu against to Hg accumulation and the toxic effects of this metal in the lysosomal system of digestive cells of adult mussels M. galloprovincialis. The histochemistry of N-acetyl-β-hexozaminidase was supported as more suitable procedure for the biomarkers’ application dealing with the digestive gland lysosomes, such as «lysosomal membrane stability» and «morphometrical alterations of lysosomes», in relation to the histochemistry of acid phosphatase and β-glucuronidase. Finally, the larger in size mussels seemed to be more influenced by environmental factors that cause «stress» compared to the small in size mussels.

Η παρούσα διατριβή αφορά στη διερεύνηση κυτταρικών και βιοχημικών βιομαρτύρων ρύπανσης σε ιστούς του μυδιού Mytilus galloprovincialis με σκοπό την ενοποίηση των αποκρίσεων τους σε έναν ενιαίο δείκτη οικολογικής ποιότητας («Health Status Index/HIS», «Lysosomal Response Index/LRI», «Integrated Biomarker Response/IBR» και ο «Πειραματικός Δείκτης Θαλάσσιας Ρύπανσης/ΔΘΡ» που προτείνεται από την παρούσα διατριβή) για την εκτίμηση της ρύπανσης θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Η εξέταση των εποχικών διακυμάνσεων των βιομαρτύρων, της αλληλεπίδρασης των βαρέων μετάλλων, της απόκρισης των διαφορετικού μεγέθους μυδιών σε ορισμένες λυσοσωμικές παραμέτρους και του ιστοχημικού εντοπισμού τριών λυσοσωμικών ενζύμων πραγματοποιήθηκε με σκοπό οι πληροφορίες που θα προκύψουν να αξιοποιηθούν σε μελέτες βιοπαρακολούθησης για την καλύτερη δυνατή εκτίμηση της ποιότητας των παράκτιων οικοσυστημάτων. Μύδια συλλέχθηκαν από το Θερμαϊκό και Στρυμονικό κόλπο το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2004 και την άνοιξη του 2005. Μύδια εκτέθηκαν σε οργανικούς ρύπους και εξετάστηκαν δύο καθιερωμένοι βιομάρτυρες («σταθερότητα λυσοσωμικής μεμβράνης/LMS» και «κατακράτηση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό/NRR)» και τρεις υπό διερεύνηση βιομάρτυρες («μορφομετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων (NL)», «συχνότητα μικροπυρήνων/MN και άλλων πυρηνικών ανωμαλιών» και «μορφομετρικές αλλαγές των λυσοσωμάτων/LYS») στον πεπτικό αδένα και την αιμόλεμφο. Επίσης, πραγματοποιήθηκε πειραματική έκθεση μυδιών σε Cu, Hg και σε μίγμα Cu και Hg και ακολούθησε μια περίοδος 7 ημερών αποτοξικοποίησης κάτω από εργαστηριακές συνθήκες. Επιπρόσθετα, μύδια συλλέχθηκαν από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο και το Δεκέμβριο του 2009 και σε κρυοτομές του πεπτικού τους αδένα εφαρμόστηκε ιστοχημεία για τα λυσοσωμικά ένζυμα Ν-ακετυλ-β-εξοζαμινιδάση, όξινη φωσφατάση και β-γλουκουρονιδάση. Τέλος, πραγματοποιήθηκε συλλογή διαφορετικού μεγέθους μυδιών (μικρά και μεγάλα μύδια) από τη Χαλάστρα τον Ιούνιο του 2010 και εξετάστηκαν στον πεπτικό τους αδένα λυσοσωμικές παράμετροι, όπως οι: «LMS», «LYS», «LRI», «δομικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων» και ιστοχημεία για τα λυσοσωμικά ένζυμα Ν-ακετυλ-β-εξοζαμινιδάση, όξινη φωσφατάση και β-γλουκουρονιδάση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποστήριξαν τους δείκτες «HIS» και «LRI» ως πολύτιμα εργαλεία τόσο για την ποσοτική όσο και για την ποιοτική εκτίμηση του περιβαλλοντικού «stress», ενώ ενίσχυσαν τον υπολογισμό του δείκτη «IBR» ως χρήσιμη μέθοδο μόνο για την ποιοτική εκτίμηση των επιπέδων ρύπανσης ανάμεσα στις επιβαρυμένες περιοχές. Η παρούσα διατριβή έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα για τη χρήση του «Πειραματικού Δείκτη Θαλάσσιας Ρύπανσης» ως εργαλείο για την εκτίμηση της ποιότητας των ελληνικών ακτών. Οι κυτταρικοί και βιοχημικοί βιομάρτυρες, με εξαίρεση το βιομάρτυρα «NRR», εμφάνισαν έντονες εποχικές διαφοροποιήσεις και ενισχύθηκε η άποψη ότι τα μέσα του καλοκαιριού αποτελούν κατάλληλη εποχή για τις δειγματοληψίες μυδιών και την εφαρμογή βιομαρτύρων που αφορούν στα λυσοσώματα. Οι «μορφομετρικές αλλαγές των ουδέτερων λιπιδίων, των λυσοσωμάτων και των λιποφουσκινών» καθώς και οι «δομικές αλλαγές του επιθηλίου των πεπτικών σωληναρίων» υποστηρίχθηκαν ως βιομάρτυρες σε μελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης. Καταδείχθηκε για πρώτη φορά η ανταγωνιστική δράση του Cu ενάντια στη συσσώρευση του Hg και στα τοξικά αποτελέσματα που έχει το μέταλλο αυτό στο λυσοσωμικό σύστημα των πεπτικών κυττάρων των ενήλικων μυδιών M. galloprovincialis. Επίσης, η Ν-ακετυλ-β-εξοζαμινιδάση έδειξε να αποτελεί καταλληλότερο λυσοσωμικό ένζυμο για την εφαρμογή των βιομαρτύρων «σταθερότητα λυσοσωμικής μεμβράνης» και «μορφομετρικές αλλαγές λυσοσωμάτων», σε σχέση με την όξινη φωσφατάση και τη β-γλουκουρονιδάση. Τέλος, τα μεγαλύτερου μεγέθους μύδια έδειξαν να επηρεάζονται σε μεγαλύτερο βαθμό από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που προκαλούν «stress» από ότι τα μικρού μεγέθους μύδια.