Μελέτη της εξωκυττάριας άμυνας στο οξειδωτικό στρες: συμβολή νέας μεθόδου μέτρησης αντιοξειδωτικής ικανότητας και οξειδωτικής κατάστασης βιολογικών υγρών ex vivo

Abstract

The aim of the present thesis is to investigate the contribution of the extarcellular environment to the protection of the whole organism against the deleterious effects of free radicals through oxidative stress induction . In order to protect itself , the cell has developed during the course of evolution a series of antioxidant defences which consist of a variety of molecules and antioxidant enzymes , both intra- and extra- cellular . The negative effect of free radicals in the normal cell function is mediated via the oxidation by them of proteins , nucleic acids and lipids . The by-products of the free radical attack are of great scientific interest as direct biomarkers of oxidative damage and as indirect biomarkers of antioxidant capacity . Current scientific data in the field of antioxidant assays ( mainly qualitative ) emphasise their inability to detect and quantify the antioxidant properties of a number of lipid-soluble substances in the extracellular environment , since these assays can detect only water-soluble antioxidants . By detecting single antioxidants every time , they are incapable of evaluating the synergistic effects that take place between the various components of the antioxidant defence in living organisms . At this point we introduce a novel assay for the evaluation , qualitative and quantitative , of the antioxidant capacity of both water- and lipid- soluble antioxidants in the extracellular environment . The “ Blue CrO5® Assay” is a patented assay based on the spectrophotometric detection of the production of a potent oxidant , CrO5 , and its degradation by the antioxidants of the measured sample . The advantage of this assay lies in its great sensitivity and the ability of CrO5 formation in the aqueous phase and its dilution in the organic phase , thus permitting the interaction of antioxidants in both phases of the measured sample . The result represents the total antioxidant capacity of the sample . This innovative assay was applied in various classic oxidative stress models , such as patients after myocardial infarction ( MI ) , and Wistar rats after intraperitoneal admnistration of catechins or ozone . Shifts in the antioxidant capacity ( TAC ) were correlated with various biomarkers of oxidative status . The assay displayed an ability to detect acute post-MI alterations of the antioxidant capacity . Furthermore , experimental data from Wistar rats displayed the flexibity of the assay in detecting alterations in the antioxidant capacity of various tissue compartments after both oxidative and non-oxidative chemical stimuli , and its validity since these data coincide with the relative international literature .

Στόχος της διατριβής είναι η μελέτη της συμβολής του εξωκυττάριου περιβάλλοντος στην προστασία του οργανισμού από βλαπτικές επιδράσεις των ελεύθερων ρίζων οξυγόνου και αζώτου στα πλαίσια του οξειδωτικού στρες . Το κύτταρο , προκειμένου να προστατευθεί έχει αναπτύξει εξελικτικά μια σειρά αμυντικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν ποικιλία χημικών μορίων και ενζυμικών συστημάτων , ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων . Η βλαπτική επίδραση των ελευθέρων ριζών στην κυτταρική λειτουργία ασκείται μέσω της προκαλούμενης από αυτά οξείδωσης πρωτεϊνών , νουκλεϊκών οξέων και λιπιδίων . Τα παραπροϊόντα αυτής της χημικής επίθεσης εμφανίζουν μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον ως άμεσοι δείκτες της προκαλούμενης οξειδωτικής βλάβης , αλλά και ως έμμεσοι δείκτες της υπάρχουσας αντιοξειδωτικής προστασίας . Από την μελέτη των μέχρι τώρα δεδομένων στο αντικείμενο των μεθόδων ανίχνευσης της αντιοξειδώτικης ικανότητας ( κυρίως ποιοτικών ) υπάρχει έντονος προβληματισμός για την τεχνική αδυναμία των υπαρχόντων μεθόδων να ανιχνεύσουν και πόσο μάλλον να ποσοτικοποιήσουν την αντιοξειδωτική δράση πληθώρας λιποδιαλυτών ουσιών του εξωκυττάριου περιβάλλοντος , μια και οι μέθοδοι αυτές μετρούν μόνο υδατοδιαλυτές ουσίες , ενώ ανιχνεύοντας μεμονωμένα αντιοξειδωτικά σώματα δεν είναι σε θέση να απεικονίσουν τα συνεργικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα μεταξύ των διαφόρων επιπέδων αντιοξειδωτικής προστασίας των έμβιων οργανισμών . Στο σημείο αυτό εισάγουμε μια νέα μέθοδο μέτρησης της αντιοξειδωτικής προστασίας , ποιοτικά και ποσοτικά , η οποία επιτρέπει την μέτρηση του συνόλου της αντιοξειδωτικής δράσης των υδατοδιαλυτών και των λιποδιαλυτών ουσιών του εξωκυττάριου περιβάλλοντος . Η « μέθοδος του κυανού του CrO5® » είναι κατοχυρωμένη με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας και βασίζεται στην φασματοφωτομετρική ανίχνευση της παραγωγής μιας ισχυρότατα οξειδωτικής ουσίας , του CrO5 , και της κατανάλωσής του από τα αντιοξειδωτικά του δείγματος . Η ιδιαιτερότητα της μεθόδου έγκειται στην μεγάλη ευαισθησία της , καθώς και στην ιδιότητα του CrO5 να σχηματίζεται στην υδατική φάση του διαλύματος και στην συνέχεια να διαλύεται στον οργανικό διαλύτη του διαλύματος , επιτρέποντας έτσι την συμμετοχή των αντιοξειδωτικών ουσιών και των δύο φάσεων του διαλύματος . Επομένως , το μετρούμενο αποτέλεσμα αντικατοπτρίζει πλήρως την συνολική αντιοξειδωτική δράση του δείγματος . Η καινοτόμος αυτή μεθοδολογία βρήκε εφαρμογή σε ποικίλα κλασσικά μοντέλα οξειδωτικού στρες , όπως σε εμφραγματίες ασθενείς όπου διενεργήθηκαν μετρήσεις σε ποικίλα χρονικά σημεία μετεφραγματικά , αλλά και σε επίμυες Wistar όπου μετρήθηκαν οι μεταβολές της αντιοξειδωτικής ικανότητας ( TAC ) σε συνδυασμό με ποικίλους δείκτες οξειδωτικής κατάστασης μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση είτε όζοντος είτε μίγματος κατεχινών . Διαπιστώθηκε η ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει πρώιμες μεταβολές της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εμφραγματιών . Τα πειραματικά δεδομένα από τους επίμυες ανέδειξαν την ευελιξία της μεθόδου ως προς την ανίχνευση μεταβολών της αντιοξειδωτικής κατάστασης στα διάφορα ιστικά διαμερίσματα μετά από ποικίλα χημικά ερεθίσματα ( οξειδωτικά και μη ) , καθώς και την εγκυρότητά της καθώς τα δεδομένα αυτά συμβαδίζουν με την διεθνή βιβλιογραφία .