Η μελέτη της επούλωσης του τραύματος σε σχέση με τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου: πειραματική μελέτη

Abstract

This study discusses the correlation between GAGs, MMPs and TIMPs and wound healing processes of human skin, in vitro and in vivo. We used cell lines and primary cell cultures, to establish an experimental wound healing model. We studied also the functionalism and compatibility of porous scaffolds using cell cultures. Finally we extended our study in mice, by investigating the wound healing process in the presence and absence of these porous scaffolds. In primary cultures of human skin fibroblasts, we studied the effect of four GAGs in wound healing. A scratch of uniform size was made across the cell single layer and hyaluronic acid (HA), dermatan sulfate (DS), chondroitin sulfate (ChS) and heparan sulfate (HS) were applied. HA and DS stimulate proliferation and migration of fibroblasts across the wound (scratch) edges, relatively to ChS and HS that showed no effect as compared to control. The gelatinolytic activity of fibroblasts was determined from the supernatant of the cell culture and it was emerged that HA and DS induces significally the enzyme activity of MMPs after 24 and 48 hours of incubation, in contrast with ChS and DS that had no effect. This MMP induction by HA and DS was also confirmed by protein determination using ELISA. Finally, we have shown that none of the four GAGs that we have studied in this experiment induced any change in the expression of TIMPs, which was not affect by the presence of a scratch. We studied the ability of fibroblasts to proliferate and migrate in a cell culture with the presence of two different porous scaffolds (chitin and PHB). The use of scanning electron microscope to study these scaffolds, demonstrated that the chitin scaffold does not allow binding and subsequent migration of fibroblasts, due to its thick structure. On the contrary, the PHB porous scaffold structure allows increased entrance of fibroblasts into it as well as the secretion of extracellular matrix by these cells. We further used an in vivo model and we created wounds on Balb/c mice’s backs and studied the healing process, in the presence or absence of the chitin and PHB porous scaffolds. Macroscopic observation showed that all wounds healed in a similar way. All mice were sacrificed in different days and skin tissue samples were studied under the photonic and electron microscope. The chitin scaffold was neither absorbed nor assimilated with the surrounding tissues; therefore its further analysis was terminated. However, we showed that the PHB scaffold induces wound healing, especially between day 3 and 7 posttraumatic, associated with increased cellularity and secretion of extracellular matrix as well as of fibroblast fibers. We reached the conclusion that HA is induced statistically significant day 1 and day 3 posttraumatic and returns to control levels by day 7. Both porous scaffolds demonstrated induction of synthesis of HA the 1st and 7th day posttraumatic in comparison with the wounds that healed in the absence of the scaffolds. We studied the enzymatic activity of MMPs in the tissue samples and we have found that proMMP-9 and MMP-9 are induced statistically significant, in comparison with control samples (tissues with no trauma). Furthermore, the chitin scaffold demonstrated statistically significant induction of MMP-9, while the PHB scaffold its inhibition. Both chitin and PHB porous scaffolds induced MMP-2 only the 1rst day posttraumatic. The results of this study indicate that hyaluronic acid and dermatan sulfate play a significant role in wound healing, regulating the enzymatic activity and secretion of MMPs. Potentially these molecules as well as porous scaffolds PHB could be used in the future for accelerating and optimization of wound healing.

H παρούσα διατριβή πραγματεύεται τη μελέτη των μορίων του εξωκυττάριου χώρου -GAGs, MMPS και TIMPs- σε σχέση με τις διαδικασίες της επούλωσης του δέρματος, in vitro και in vivo. Xρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές και αναπτύχθηκαν κυτταροκαλλιέργειες στις οποίες εφαρμόστηκε το πειραματικό μας μοντέλο επούλωσης. Μελετήθηκαν διάφορα πλέγματα-ικριώματα στις κυτταροκαλλιέργειες με σκοπό την λειτουργικότητα και συμβατότητά τους με τις κυτταροκαλλιέργειες. Τέλος, εξετάστηκε η επούλωση σε πειραματόζωα, παρουσία και απουσία των πλεγμάτων. Αναλυτικότερα ολοκληρώθηκαν τα εξής πειράματα: 1) Σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών μελετήθηκε η επίδραση GAGs, συγκεκριμένα του υαλουρονικού οξέος (ΗΑ), της θεϊκής δερματάνης (DS), της θεϊκής χονδροϊτίνης (ChS) και της θεϊκής ηπαράνης (HS), στην επούλωση μετά από πρόκληση τραύματος πάνω σε μονοστιβάδα δερματικών ινοβλαστών σε σχέση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το HA και η DS διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ινοβλαστών στην περιοχή του τραύματος, συγκριτικά με τη ChS, τη HS και το μάρτυρα. Μετρώντας τη ζελατινολυτική δραστηριότητα των ινοβλαστών από τα υπερκείμενα των κυτταροκαλλιεργειών διαπιστώθηκε ότι το HA και η DS επάγουν σημαντικά την ενζυμική δραστηριότητα των ΜΜΡs μετά από 24 και 48 ώρες επώασης, σε αντίθεση με τις ChS και HS που δεν προκαλούν καμία αλλαγή. Η επαγωγή αυτή των ΜΜΡs από το ΗΑ και τη DS επιβεβαιώθηκε και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με μέτρηση με ELISA. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι καμία από τις GAGs που μελετήθηκαν δεν προκάλεσε μεταβολή της έκφρασης του TIMP-1 παρουσία ή απουσία τραύματος. 2) Στη συνέχεια, μελετήσαμε την ικανότητα των ινοβλαστών να πολλαπλασιάζονται και να μεταναστεύουν σε κυτταροκαλλιέργειες παρουσία δύο τύπων πλεγμάτων-ικριωμάτων, (χιτίνης και PHB). Η μελέτη των πλεγμάτων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως έδειξε πως το πλέγμα χιτίνης δεν επιτρέπει την είσοδο των ινοβλαστών σε αυτό, πιθανόν λόγω της πυκνής δομής του. Αντίθετα, η δομή του PHB πλέγματος επέτρεψε τη είσοδο κυττάρων σε αυτό, καθώς και την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας από τα κύτταρα. 3) In vivo, μελετήθηκε η επούλωση τραυμάτων που προκλήθηκαν σε ράχες μυών Balb/c και αφέθηκαν να επουλωθούν παρουσία και απουσία των πλεγμάτων χιτίνης και PHB. Καμία διαφορά στην επούλωση δεν παρατηρήθηκε μακροσκοπικά στα τραύματα. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και τα ιστοτεμάχια δέρματος μελετήθηκαν στο οπτικό και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Το πλέγμα χιτίνης δεν απορροφήθηκε ούτε αφομοιώθηκε από τους γύρω ιστούς και έτσι η μικροσκόπισή του δεν πραγματοποιήθηκε. Το πλέγμα PHB επάγει την επούλωση κυρίως από την 3η έως και την 7η ημέρα μετατραυματικά, με αυξημένη κυτταροβρίθεια και παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας καθώς και κολλαγόνων ινών. Xρησιμοποιήσαμε μοριακές και βιοχημικές μεθόδους για τη μελέτη των ιστοτεμαχίων του δέρματος των μυών. και διαπιστώσαμε ότι το HA επάγεται στατιστικά σημαντικά την 1η και 3η ημέρα μετατραυματικά και επανέρχεται στα επίπεδα του μάρτυρα την 7η ημέρα. Τα δύο πλέγματα έδειξαν ότι προκαλούν επαγωγή της σύνθεσης του ΗΑ την 1η και 3η ημέρα, συγκριτικά με τις περιοχές όπου τα πλέγματα απουσίαζαν. Μελετήσαμε την ενζυμική δραστηριότητα των MMPs και παρατηρήσαμε ότι η proMMP-9 και η MMP-9 επάγονται στατιστικά σημαντικά την 3η και 7η ημέρα μετατραυματικά συγκριτικά με το μάρτυρα. Σε αντιδιαστολή η proMMP-2 και MMP-2 δεν παρουσιάζουν καμία διαφορά μετατραυματικά συγκριτικά με το μάρτυρα (ιστός χωρίς τραύμα). Σε ότι αφορά τα πλέγματα διαπιστώσαμε ότι το πλέγμα χιτίνης προκαλεί στατιστικά σημαντική επαγωγή στην έκφραση της MMP-9 ενώ το πλέγμα PHB αναστολή της. Η MMP-2 επάγεται και από τα δύο πλέγματα μόνο την 1η ημέρα μετατραυματικά. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής υποδεικνύουν πως το υαλουρονικό οξύ και η θειική δερματάνη ρυθμίζουν την ενζυμική δραστηριότητα και έκκριση των MMPs. Ενδεχόμενα τα μόρια αυτά καθώς και τα πλέγματα-ικριώματα PHB να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον για την επιτάχυνση και βελτιστοποίηση της επούλωσης των τραυμάτων.