Ιστοτεχνολογική ανάπτυξη εξατομικευμένου χόνδρινου εμφυτεύματος από ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα λιπώδους ιστού, σε τρισδιάστατο εκτυπωμένο ικρίωμα με χρήση προηγμένων μεθόδων κατασκευής CAD/CAM και βιοαντιδραστήρα

Abstract

Additive Manufacturing was used to fabricate 3D-printed poly (ε-caprolactone) scaffolds of different geometry topologies and porosities. A comparative analysis was made to present hyaline cartilage development from human Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells (ADMSCs) on three different, newly designed scaffold geometry patterns. All scaffolds were examined for cell proliferation, colonization, and differentiation, in relation to the scaffold's structure, as well as to the mechanical properties of the final constructs. Emphasis was given on the scaffold’s microarchitecture and macroarchitecture, for optimal and enhanced chondrogenic differentiation, as an important parameter, not well studied in the literature. Among the three patterns tested, RO45 was the most favorable for chondrogenic differentiation, whereas 3DHC better supported cell proliferation and scaffold penetration, exhibiting also the highest rate of increase of the final construct’s mechanical properties. It is concluded that by choosing the optimal scaffold architecture, the resulting properties of these cartilaginous constructs can better approximate those of the normal cartilage. In addition, the most favorable microenvironment was determined to better support cell proliferation and differentiation. For this purpose, a perfusion bioreactor was used, which is attracting researcher’s attention as an effective, modern tool in tissue engineering applications. Collagen was also applied to PCL scaffolds as a natural biomaterial with outstanding biocompatibility, biodegradability, and non-toxic characteristics. 3D printed polycaprolactone (PCL) scaffolds with rectangular pores were coated with collagen either as a coating on the scaffold’s trabeculae, or as a gel-cell solution penetrating scaffolds’ pore. Two different differentiation culture media were used to test chondrogenic differentiation in scaffolds with or without collagen, under static and dynamic culture conditions. Dynamic culture achieved better penetration and uniform distribution of the cells within the scaffold. Furthermore, non-collagen scaffolds combined with the in house TGF-β2 based medium, augmented chondrogenic differentiation performance as a result of the beneficial mechanical stimulus of dynamic culture. Cell adhesion on 3D-scaffolds is the first challenging task in order to succeed high cell densities and even cell distribution. For this purpose, a 3D-cell Culture Device (3D-CD) was designed for static seeding and cultivation, intended to be used with any kind of scaffold, limiting cell loss and facilitating nutrient supply. 3D printing technology was used for both scaffold and device fabrication. Apart from testing the device, the purpose of this study was to assess and compare static and dynamic seeding in normoxic and hypoxic conditions, and their effects on parameters such as cell seeding efficiency, cell distribution and cell proliferation. The 3D-cell Culture Device (3D-CD) enhanced cell seeding efficiency with almost no cell loss and achieved uniform cell distribution in all scaffold ‘zones’, processed and analyzed by micro-CT scans and projection images.Chondrogenic differentiation was further evaluated with this device (3D-CD). 3D printed PCL scaffolds fixed on the (3D-CD) device, seeded with hADMSCs and cultured under normoxia or hypoxia. The culture device (3D-CD) in combination with hypoxic culture conditions resulted in a hyaline like cartilage tissue which overall exhibited ideal characteristics, such as an abundant extracellular matrix (ECM), rich in glycosaminoglycans and proteoglycans, and with a significantly high proportion of type II collagen to type I collagen. Finally, it is worth mentioning that the resulting mechanical properties can withstand even the most extreme conditions of daily mechanical stresses within the joints.

Στην παρούσα Διατριβή χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία ‘προσθετικής κατασκευής’ (Additive Manufacturing) και συγκεκριμένα η μοντελοποίηση με απόθεση τήξης (FDM) και τρισδιάστατη εκτύπωση (3D printing) για την κατασκευή τρισδιάστατων τυπωμένων ικριωμάτων πολυκαπρολακτόνης διαφορετικών γεωμετρικών πόρων και μικρο-αρχιτεκτονικής δομής. Παρουσιάστηκε μια συγκριτική ανάλυση ανάπτυξης υαλοειδούς χόνδρου από διαφοροποιημένα μεσεγχυματικά κύτταρα προερχόμενα από ανθρώπινο λιπώδη ιστό (hADMSCs) σε τρία διαφορετικά και πρωτότυπα ικριώματα στην εσωτερική δομή τους. Αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ο εποικισμός και η διαφοροποίησή τους, σε σχέση με τη δομή του κάθε ικριώματος, καθώς και οι μηχανικές ιδιότητες των τελικών κατασκευών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε τόσο στην μάκρο- όσο και στην μίκρο-αρχιτεκτονική, για την βέλτιστη χονδρογενή διαφοροποίηση, ως μία σημαντική παράμετρος που δεν έχει μελετηθεί καλά στη βιβλιογραφία. Μεταξύ των τριών ικριωμάτων που δοκιμάστηκαν, το RO45 ήταν ευνοϊκότερο για χονδρογενή διαφοροποίηση, ενώ το 3DHC υποστήριξε καλύτερα τον πολλαπλασιασμό και την διείσδυση των κυττάρων εντός του ικριώματος, παρουσιάζοντας επίσης και τον υψηλότερο ρυθμό αύξησης στις μηχανικές ιδιότητες του τελικού αναγεννημένου χόνδρινου ιστού. Προσδιορίστηκε επίσης το πιο ευνοϊκό περιβάλλον για την ιδανικότερη υποστήριξη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε βιοαντιδραστήρας διάχυσης (perfusion bioreactor) που προσελκύει συνεχώς την προσοχή των ερευνητών ως ένα αποτελεσματικό και σύγχρονο εργαλείο στη μηχανική ιστών. Επίσης εφαρμόστηκε ένα φυσικό βιοϋλικό ευρέως διαδεδομένο στην Αναγεννητική Ιατρική, με εξαιρετική βιοσυμβατότητα, βιοαποικοδομησιμότητα και μη τοξικά χαρακτηριστικά. Πρόκειται για το κολλαγόνο, μια δομική πρωτεΐνη με αδιαμφισβήτητα ευεργετικά χαρακτηριστικά. Η μελέτη εκτελέστηκε σε τρισδιάστατα εκτυπωμένα ικριώματα πολυκαπρολακτόνης που παρασκευάστηκαν με τετράγωνους πόρους. Το κολλαγόνο είτε εφαρμόστηκε μεμονωμένα και επικάλυψε τις ίνες του ικριώματος, είτε εφαρμόστηκε ως ένα διάλυμα γέλης κολλαγόνου και κύτταρων που συνολικά διείσδυσε στους πόρους των ικριωμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον δύο διαφορετικά μέσα διαφοροποίησης για τον έλεγχο της χονδρογενούς διαφοροποίησης σε όλα τα ικριώματα, σε συνθήκες στατικής και δυναμικής καλλιέργειας με βιοαντιδραστήρες διάχυσης. Στη δυναμική καλλιέργεια, τα κύτταρα στα ικριώματα χωρίς την προσθήκη κολλαγόνου είχαν καλύτερη διείσδυση και πιο ομοιόμορφη κατανομή εντός του ικριώματος. Αυτά δε που συνδυάστηκαν με το μέσο χονδρογενούς διαφοροποίησης βασισμένο στον αυξητικό παράγοντα TGF-β2, έδειξαν επαυξημένη χονδρογενή διαφοροποίηση που οφείλονταν στο ευεργετικό μηχανικό ερέθισμα της δυναμικής καλλιέργειας. Περαιτέρω, μελετήθηκε η αρχική προσκόλληση των κυττάρων στα τρισδιάστατα ικριώματα, για να επιτευχθεί υψηλή πυκνότητα κυττάρων και ακόμη πιο ομοιόμορφη κατανομή κυττάρων, που γενικά θεωρείται μια πρόκληση σε εφαρμογές Ιστομηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκε, κατασκευάστηκε και μελετήθηκε μια πρωτότυπη συσκευή τρισδιάστατης καλλιέργειας κυττάρων (3D-CD) για στατική καλλιέργεια με γνώμονα τον περιορισμό απώλειας κυττάρων κατά την έγχυση και την διευκόλυνση παροχής θρεπτικών ουσιών. Η τεχνολογία τρισδιάστατης εκτύπωσης (3D printing) χρησιμοποιήθηκε τόσο για το ικρίωμα όσο και για την κατασκευή της συσκευής καλλιέργειας. Εκτός από τη δοκιμή της συσκευής, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εκτιμηθούν και να συγκριθούν οι στατικές και δυναμικές μέθοδοι έγχυσης και οι συνθήκες καλλιέργειας των κυττάρων, υπό κανονικές και υποξικές συνθήκες (normoxia and hypoxia) και τα αποτελέσματά τους σε παραμέτρους όπως η αποτελεσματικότητα διασποράς των κυττάρων, η κατανομή των κυττάρων και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Η συσκευή καλλιέργειας (3D-CD) βελτίωσε την αποτελεσματικότητα έγχυσης των κυττάρων με σχεδόν μηδαμινή απώλεια κυττάρων και με ομοιόμορφο εποικισμό σε όλες τις ζώνες του ικριώματος, όπως αναδείχθηκε από τις χρησιμοποιούμενες τεχνικές σάρωσης με μικροτομογράφο (micro-CT). Σε επόμενη φάση αξιολογήθηκε η περαιτέρω διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων με αυτή την συσκευή και σε συνθήκες νορμοξίας ή υποξίας. Η μέθοδος διαφοροποίησης στην πρωτότυπη συσκευή σε συνδυασμό με τις συνθήκες υποξίας είχε ως αποτέλεσμα την αναγέννηση ιστού χόνδρου με ιδανικά χαρακτηριστικά όπως άφθονη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) πλούσια σε γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες, αλλά επίσης και αρκετά αυξημένη αναλογία σε κολλαγόνο τύπου ΙΙ έναντι του κολλαγόνου τύπου Ι, όπως και στο φυσιολογικό υαλοειδή χόνδρο. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι οι μηχανικές ιδιότητες που προέκυψαν μπορούν να αντέξουν ακόμη και τις πιο ακραίες συνθήκες της καθημερινής καταπόνησης των αρθρώσεων.