Νέα στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων από παραδοσιακά ελληνικά τυριά: μελέτη του τεχνολογικού δυναμικού, των φυσιολογικών ιδιοτήτων και του πλασμιδιακού περιεχομένου

Abstract

The purpose of this study was the isolation of wild strains of lactic acid bacteria from traditional Greek cheeses, the investigation of their technological potential, their physiological properties and their plasmid content. Initially the microflora of Formaella, Kopanisti, Feta and Mana cheeses was explored. A total of 133 lactic acid bacteria were isolated and screened for their biochemical properties. The SDS-PAGE the PFGE and the sequencing of 16S rDNA revealed that Lb. rennni and Lb. acidipiscis were the sole microbial species in Kopanisti and Mana cheese while they were found to produce a series of volatile compounds important for cheese flavor. The potential application of four strains (Lb. bulgaricus, S. thermophilus, Lb. paracasei and E. faecalis) was surveyed in a pilot scale goat milk cheesemaking. The end product was a soft cheese with mild flavor good texture and acceptable microbiological and physicochemical characteristics. The second section involved the study of the transcriptional changes in the cells of Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 under osmotic stress conditions RAP-PCR analysis led to the characterization of six differentially expressed genes while RT-PCR confirmed the changes in the RNA profiles. Among the genes found to be induced were those coding for the IIA and MB subunit of the mannose/sorbose PEP-PTS. At high NaCl concentrations the growth of Lb. acidipiscis was significantly enhanced in the presence of mannose and/or sorbose while the mannose/sorbose PEP-PTS activity increased indicating that these compounds are two novel osmolytes with comparable protective effect to the osmolyte glycine betaine. In the third section the plasmid content of three strains was investigated. Plasmid pLAC1 of Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 carries four orfs (rep, orf2, orf3 and mob). Ab initio analysis and RT PCR showed that rep orf2 and orf3 are polycistronically co transcribed. Plasmid pREN of Lb. rennmi ACA-DC 1534 has six orfs (repA, orf2, mobC, mobA1, mobA2 and mobB) with repA and orf2 forming a novel operon. The organization of the origin of replication (orf) along with the pattern of similarity of RepA protein renders pREN as a new member of the pUCL287 theta replicating family of plasmids. Phylogenetic analysis of the plasmid proteins suggests that pLAC1 and pREN are products of a modular evolution process. Finally plasmid pPS1 of Ρ. pentosaceus ACA-DC 3431 carries the gsiB gene that in Bacillalles belongs to the sigma Β general stress regulon GsiB is a LEA hydrophilin and this is the first report for the existence of this protein in lactic acid bacteria. Phylogenetic analysis demonstrated that lactic acid bacteria GsiBs share a common ancestor with the GsiB of Paenibacillus/Geobacillus suggesting that the former proteins were acquired through horizontal gene transfer (HGT) and that most probably the original donor was a Bacillales organism.

Σκοπός της μελέτης ήταν η απομόνωση άγριων στελεχών οξυγαλακτικών βακτηρίων απόπαραδοσιακά Ελληνικά τυριά, η μελέτη του τεχνολογικού τους δυναμικού, των φυσιολογικών τους ιδιοτήτων και του πλασμιδιακού τους περιεχομένου. Αρχικά διερευνήθηκε η μικροχλωρίδα των τυριών Φορμαέλλα, Κοπανιστή Φέτα και Μάνα. Απομονώθηκαν 133 οξυγαλακτικά βακτήρια και μελετήθηκαν ως προς τις βιοχημικές τους ιδιότητες. Η SDS-PAGE, η PFGE και η αλληλούχηση του 16S rDNA έδειξαν ότι οι Lb. rennini και Lb. acidipiscis ήταν τα μοναδικά μικροβιακά είδη στην Κοπανιστή και τη Μάνα και παρήγαγαν ένα σύνολο πτητικών ενώσεων σημαντικών για το άρωμα γεύση στα τυριά. Τέλος εξετάστηκε η απόδοση τεσσάρων στελεχών (Lb. bulgaricus S thermophilus Lb. paracasei και E faecalis) στην πιλοτική παραγωγή γίδινου τυριού. Το τελικό προϊόν ήταν ένα μαλακό τυρί με ήπιο άρωμα γεύση καλή υφή και αποδεκτά μικροβιολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά. Η δεύτερη ενότητα αφορούσε τη διερεύνηση των μεταγραφικών αλλαγών κυττάρων του Lb. Acidipiscis ACA-DC 1533 σε συνθήκες ωσμωτικού στρες. Η ανάλυση RAP-PCR οδήγησε στον χαρακτηρισμό έξι γονιδίων διαφορικής έκφρασης ενώ η RT-PCR επιβεβαίωσε τις αλλαγές στα προφίλ του RNA. Ανάμεσα στα γονίδια που βρέθηκαν να επάγονται ήταν και αυτά που κωδικοποιούν την υπομονάδα IIB και IIA του συστήματος PEP-PTS μαννόζης/σορβόζης. Σε υψηλές συγκεντρώσεις NaCl παρατηρήθηκε βελτίωση της ανάπτυξης του Lb. acidipiscis παρουσία μαννοζης ή/και σορβόζης και αύξηση της ενεργότητας του συστήματος PEP-PTS μαννόζης/σορβόζης υποδεικνύοντας ότι αυτές οι ενώσεις αποτελούν δύο νέους ωσμωλύτες αντίστοιχης προστατευτικής δράσης με τον ωσμωλύτη γλυκίνη βεταίνη. Στο τρίτο στάδιο διερευνήθηκε το πλασμιδιακό περιεχόμενο τριών στελεχών. Το πλασμίδιο pLAC1 του Lb. acidipiscis ACA-DC 1533 φέρει τέσσερα orfs (rep orf2 orf3 και mob). Η ab initio ανάλυση και η RT-PCR έδειξαν ότι τα γονίδια rep orf2 και orf3 συν μεταγράφονται πολυσιστρονικά. Το πλασμίδιο pREN του Lb. rennini ACA-DC 1534 φέρει έξι orfs (repA, orf2, mobC, mobA1, mobA2 και mobB) με τα repA και orf2 να σχηματίζουν ένα νέο οπερόνιο. Η οργάνωση του σημείου έναρξης της αντιγραφής (orf) σε συνδυασμό με το μοτίβο ομοιότητας της πρωτεΐνης RepA καθιστά το pREN νέο μέλος της οικογένειας πλασμιδίων pUCL287 (θήτα αντιγραφή). Η συγκριτική ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας έδειξε ότι το pREN διαθέτει διαφορετική δομή σκελετού αντιγραφής και κινητοποίησης μέσα στην οικογένεια pUCL287. Η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών των πλασμιδίων pLAC1 και του pREN έδειξε ότι και τα δυο μόρια προέκυψαν μέσω μιας εξελικτικής διαδικασίας συναρμολόγησης. Τέλος το πλασμίδιο pPS1 του Ρ. pentosaceus ACA-DC 3431 φέρει το γονίδιο gsiB που στα Bacillalles ανήκει στο σίγμα Β ρεγουλόνιο γενικού στρες ενώ η πρωτεΐνη GsiB είναι μια LEA πρωτεΐνη και η ύπαρξη της περιγράφεται για πρώτη φορά στα οξυγαλακτικά βακτήρια. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε οτι τα οξυγαλακτικά βακτήρια έχουν αποκτήσει τις πρωτεΐνες GsiB από έναν κοινό πρόγονο με τους Paenibacillus/Geobacillus μέσω οριζόντιας μεταφοράς γονίδιων (HGT) και ότι πιθανότατα ο αρχικός δότης ανήκει στα Bacillales.