Ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης αμινοξέων και αυτοματοποιημένων διαδικασιών κατεργασίας σε μεθόδους LC-MS / MS

Abstract

In the present study, novel and automated methods were developed for the determination of pharmaceutical compounds and analytes of great biological importance in the presence of biological fluids or not, with the employment of LC-MS/MS technique. It is well known that methods developed with LC-MS/MS technique are characterized by great sensitivity and specificity. In any case, the objective beyond the spectrometric and chromatographic optimization was to find all those conditions and parameters that lead to optimizing the response of each system under consideration. In the first section, the aim was signal optimization of some basic and non-natural amino acids in pure solutions. Amino acids are poorly ionized, thus their detection with mass spectrometry often becomes problematic. Derivatization as a technique of signal boosting of these analytes is commonly used. Taking into consideration the chemical properties that must characterize a derivative detectable with LC-MS/MS, new derivatization agents C1- DAPS and C4-DAPS were synthesized. More specifically, these agents were designed so that the formed derivatives (i) to carry a permanent positive charge as a quaternary ammonium cation, (ii) to possess a significant hydrophobic part and (iii) to provide with the same characteristic daughter ion after fragmentation of precursor ions, for further selectivity. Afterwards, a chromatographic method for the derivatives determination was developed and a central composite design was applied for the optimization of derivatization reaction conditions. Finally, comparison between these novel amino acid derivatives and non derivatized ones was conducted. Comparative study was also conducted between these derivatives and amino acid butyl esters after amino acid derivatization with 1-butanol in HCl 3M. This derivatizing agent was used as a comparative measure as it is commonly used in bibliography for amino acids signal enhancement. Response evaluation was attained with column chromatography as well as with flow injection analysis. In conclusion, C1-DAPS and C4-DAPS agents enhance considerably amino acids detection signal (up to 52 times for C1-DAPS and up to 23 for C4-DAPS) and especially glycine detection signal (up to 4500 and 2800 respectively). Comparing C1-DAPS derivatives to butyl esters signal enhancement, the superiority of the first group was clear for all amino acids under examination. C4-DAPS agent exhibited either enhanced response or of the same level with that of butyl esters. As far as derivatization procedure is concerned, it can be characterized as operationally simple, and fast, since derivatives are formed instantaneously, whereas derivatization reaction by satisfactory repeatability. Referring to derivatization protocol exploitation perspectives in biological fluids, it could be applied to cases of analytes’ quantitation carrying amino group, and particularly

Στην παρούσα εργασία, αναπτύχθηκαν νέες και αυτοματοποιημένες μέθοδοι για τον προσδιορισμό φαρμάκων και ενώσεων βιολογικής σημασίας παρουσία βιολογικών υγρών ή μη με την τεχνική LC-MS/MS. Ως γνωστόν, η ανάπτυξη μεθόδων με την τεχνική LC-MS/MS χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα. Στόχος, σε κάθε περίπτωση, πέρα από τη φασματομετρική και χρωματογραφική βελτιστοποίηση, ήταν η εύρεση όλων εκείνων των συνθηκών και παραμέτρων που οδηγούσαν στη βελτιστοποίηση της απόκρισης του εκάστοτε υπό εξέταση σύστηματος. Στο πρώτο μέρος, στόχος ήταν η βελτιστοποίηση του σήματος ορισμένων βασικών και συνθετικών αμινοξέων σε καθαρά διαλύματα. Τα αμινοξέα, ως ελεύθεροι αναλύτες, δεν έχουν μεγάλη ικανότητα ιοντισμού με αποτέλεσμα η ανίχνευσή τους με τη φασματομετρία μαζών να είναι συχνά προβληματική. Η παραγωγοποίηση ως τεχνική ενίσχυσης του σήματος των συγκεκριμένων αναλυτών είναι συνήθης και ευρέως διαδεδομένη πρακτική. Μελετώντας τις χημικές ιδιότητες που πρέπει να διαθέτει ένα παράγωγο ως προuπόθεση για τον προσδιορισμό του με την τεχνική LC-MS/MS, συνετέθησαν νέοι παράγοντες παραγωγοποίησης C1-DAPS και C4-DAPS οι οποίοι θα προσέδιδαν στα παραγωγοποιημένα αμινοξέα τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, οι παράγοντες αυτοί σχεδιάστηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε τα παράγωγα (i) να φέρουν σταθερό θετικό φορτίο υπό τη μορφή του άλατος του τεταρτοταγούς αμμωνίου, (ii) να διαθέτουν σημαντικό υδρόφοβο τμήμα και (iii) να δίνουν όλα το ίδιο θυγατρικό ιόν έπειτα από θραυσματοποίηση των μητρικών τους ιόντων, για μεγαλύτερη εκλεκτικότητα. Ακολούθως, αναπτύχθηκε χρωματογραφική μέθοδος προσδιορισμού των παραγώγων, ενώ βελτιστοποιήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού, και συγκεκριμένα με κεντρικό σύνθετο σχεδιασμό, οι παράμετροι εκείνες οι οποίες επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης. Επόμενο στάδιο ήταν η σύγκριση των αποκρίσεων των παραγώγων των αμινοξέων με τους νέους παράγοντες C1-DAPS και C4-DAPS με αυτές των μη παραγωγοποιημένων αμινοξέων. Επίσης, έγινε σύγκριση μεταξύ των νέων αυτών παραγώγων και των βουτυλεστέρων των αμινοξέων που προκύπτουν έπειτα από παραγωγοποίηση αυτών με 1-βουτανόλη σε υδροχλωρικό οξύ 3Μ. Ο παράγοντας αυτός παραγωγοποίησης χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο σύγκρισης, καθώς είναι βιβλιογραφικά αποδεδειγμένο πως ενισχύει το σήμα ανίχνευσης των αμινοξέων συνδεόμενος με αυτά. Η αξιολόγηση των αποκρίσεων πραγματοποιήθηκε τόσο με χρήση χρωματογραφικής στήλης όσο με απευθείας έγχυση δείγματος. Συμπερασματικά, οι παράγοντες C1-DAPS και C4-DAPS ενισχύουν σημαντικά το σήμα ανίχνευσης των αμινοξέων (έως και 52 φορές για τον παράγοντα C1-DAPS και έως 23 για τον C4-DAPS) και ιδιαίτερα εκείνο της γλυκίνης (περί τις 4500 και 2800 φορές αντίστοιχα). Όσον αφορά, δε, στην αύξηση σήματος που επιτυγχάνεται έναντι των βουτυλεστέρων, η υπεροχή των C1-DAPS παραγώγων ήταν ξεκάθαρη με την ένταση του σήματος σαφώς σημαντικά ενισχυμένη για όλα τα αμινοξέα. Ο παράγοντας C4-DAPS εμφάνισε στην πλειοψηφία των αμινοξέων βελτιωμένη ή παραπλήσια ένταση σήματος με αυτή των βουτυλεστέρων...