Κυτταροβιολογική μελέτη των μηχανισμών απόπτωσης σε πρότυπα βιολογικά συστήματα

Abstract

Ontogenesis includes the process of oogenesis, which results to the formation of the complex oocyte in females. The mechanisms of oogenesis are well studied in a large variety of insects. The ovarian system in Lepidoptera is polytrophic, meaning that the oocyte is interconnected with a number of nutritive cells, the nurse cells. Both the oocyte and the nurse cells derive from successive divisions of a single stem-line oogonium (germ line cells). In the domesticated silkmoth Bombyx mori, ovarian development occurs during pupation and pharate adult development. The female insects have a pair of ovaries, each one consisting of four ovarioles, in which more than 100 follicles are arranged in a linear array, in progressively advanced stages of development. Each egg chamber is a functional developing unit consisting of three cell types: an oocyte, seven nurse cells and a surrounding single layer of approximately 5000 follicle cells of mesodermal origin. There are three distinct developmental periods during the maturation of the follicles, evolved along the length of the ovariole, from the anterior to the posterior pole, which correspond to previtellogenesis, vitellogenesis and choriogenesis, respectively. During their maturation, the follicles pass through the ovarioles and undergo successively vitellogenesis (yolk uptake) and choriogenesis (chorion, or egg shell, formation). Oogenesis of the silkworm B. mori, was initially divided into 7 stages and later subdivided into 12 stages, based on exclusively morphological criteria. According to the previously reported developmental profile of Bombyx mori oogenesis, stages 1-3 refer to previtellogenesis, 4-10 to vitellogenesis and 11-12 to choriogenesis. In the ladybeetle Adalia bipunctata (Coleoptera) ovarian development also occurs during pupation and pharate adult development. The female insects obtain a pair of ovaries, each one consisting of four ovarioles. The ovarian system of the ladybeetle is telotrophic, meaning that the germ line cells that are programmed to differentiate into nurse cells remain in the germarium, forming the tropharium, which is attached to the developing oocytes through the nutritive cords. Therefore, each ovary of that type consists of ovarioles, which comprise a tropharium and 1 to 4 oocytes of different developmental stages. Programmed cell death (PCD) is an evolutionary conserved and genetically regulated active program of cell elimination that occurs normally in multicellular organisms, during several physiological. Until recently, PCD was considered to be confined to the mechanisms of apoptosis. However, accumulating morphological and biochemical evidence strongly suggest that PCD includes not only apoptosis, but other forms of active self-destruction as well, such as the autophagic cell death. PCD can be classified in two major categories: type I, or apoptosis and type II, or autophagic cell death. Apoptosis is associated with characteristic morphological changes, such as early condensation of the nuclear chromatin into dense masses, fragmentation of genomic DNA, cytoplasm shrinkage, reorganization of the actin cytoskeleton and shattering of the dying cell content into apoptotic bodies that are efficiently phagocytosed by surrounding cells or phagocytes. In contrast, during autophagy all cellular contents are disintegrated into autophagic bodies and destroyed by the cell’s own lysosomes. It is important to denote that previous studies have revealed the occurrence of both apoptotic and autophagic cell death in the same tissue. The major effector molecules of apoptosis are cysteine proteases, called caspases. Caspases are synthesized as inactive pro-enzyme precursors (zymogens, pro-caspases), which are processed by proteolytic cleavages at specific aspartic acid residues, resulting in the generation of respective activated caspases containing a large (~p20) and small (~p10) subunit. In living cells, caspases are present as inactive precursors, but as soon as they receive an apoptotic signal they undergo proteolytic processing and adopt their active form. The role of caspases in apoptosis has been adequately analyzed in several species. In mammals, there have been 14 caspases discovered, so far and the majority of them are essentially involved in apoptosis. In Drosophila melanogaster, there have been found 7 caspase family members and in B. mori only one homologous protein, named as caspase-1. In the present study, we demonstrate for the first time that in the silkmoth B. mori (Lepidoptera) and in the ladybeetle Adalia bipunctata (Coleoptera) the two types of programmed cell death, apoptosis and autophagy, function together during oogenesis. We propose that the apoptotic and autophagic cell death programs operate synergistically during oogenesis, in order to efficiently and rapidly eliminate the degenerated nurse cell cluster. In order to accomplish our goal, we have used conventional light and electron microscopy, as well as specific fluorescent markers for autophagy and apoptosis. In the silkmoth Bombyx mori, electron microscopy studies, along with several in vitro assays, reveal the presence of programmed cell death of the ovarian nurse cells, in the last developmental stages of vitellogenesis. At developmental stage 5, the nurse cells occupy one half of the follicular volume and obtain a rather spherical shape, while the nurse cell nuclei appear large, elongated, forming impressive projections. At the following stage 6, the nurse cells decrease in size and their shape becomes elliptic. The nuclei remain elongated, being also characterized by large lobes. The lobes of the ramified nurse cell nuclei seem to retain the nucleus in the center of the cell during the dumping of the nurse cell cytoplasm into the growing oocyte. At stage 7, membrane enclosed large vacuoles can be easily detected into the nurse cell cluster cytoplasm. Ultrastructural analysis of these vacuoles combined with the mono-dansyl-cadaverine staining approach reveal that they virtually represent autophagic vacuoles. Caspase activity is unambiguously detected during stage 7, as it is demonstrated by using the Red-VAD-FMK staining reagent. At developmental stages 8 and 9, the nurse cells exhibit chromatin condensation, DNA fragmentation and caspase activity. Finally, during the following stage 10, the nuclear remnants are assembled into apoptotic vesicles, which, after being phagocytosed, are observed in the cytoplasm of adjacent follicle cells. We propose that apoptosis and autophagy operate synergistically during vitellogenesis of B. mori, in order to achieve an efficient and rapid clearance of the degenerated nurse cell cluster. In the ladybeetle Adalia bipunctata we thoroughly investigated the features of programmed cell death of the ovarian tropharium, occurring during oogenesis, at various developmental ages. The follicles from female adult insects at the ages of 10 and 20 days are not characterized by chromatin condensation, DNA fragmentation and caspase activity, as shown after staining with DAPI, acridine and Red-VAD-fmk reagents, respectively. The use of the mono-dansyl-cadaverine staining approach revealed that the tropharium is neither characterised by the presence of autophagic vacuoles. On the contrary, the follicle tropharium from female adult insects at the ages of 25 and 30 days exhibit all the typical programmed cell death morphological features, such as chromatin condensation, DNA fragmentation, caspase activity and autophagic vacuoles. As a conclusion, we propose that during oogenesis of Adalia bipunctata, apoptosis and autophagy operate synergistically, in order to achieve an efficient and rapid clearance of the degenerated nurse cell cluster. The observed sporadic appearance of death features during oogenesis of reproductively active insects (ages 10 and 20 days) could constitute a possible effort to destroy some abnormal nurse cells in the tropharium, in order to secure the follicles further normal development. To conclude with, it is known that apoptotic and autophagic cell death are not mutually exclusive phenomena. Both types of PCD can occur either simultaneously or successively, during development. Interestingly, in Drosophila salivary glands during metamorphosis, cell death includes autophagocytosis, but also requires caspase activity. Caspase activity and the presence of autolysosomes are simultaneously detected in the Bombyx mori nurse cell cluster during developmental stage 7, as well as in the tropharium of Adalia bipunctata oocytes, indicating that these processes can function together in a cooperative fashion during oogenesis in both, Lepidoptera and Coleoptera. The totality of the presented data demonstrates the synergistic coexistence of apoptosis and autophagy during PCD in the ovarian nurse cells of various insect orders. This phenomenon seems to comprise a delicate mechanism for a better and faster absorption of the degenerating nurse cells after the completion of their nutritive support to the growing oocyte.

Η ωογένεση στα έντομα αποτελεί ένα πρότυπο σύστημα μελέτης κύτταρο βιολογικών αναπτυξιακών μηχανισμών. Στο Λεπιδόπτερο Bombyx mori, η ανάπτυξη των ωοθηκών πραγματοποιείται κατά το αναπτυξιακό στάδιο της νύμφης, καθώς και κατά τη διάρκεια του μεταβατικού σταδίου, από νύμφη σε ενήλικο άτομο. Κάθε θηλυκό έντομο διαθέτει ένα ζευγάρι ωοθηκών πολυτροφικού μεροϊστικού τύπου. Κάθε ωοθήκη αποτελείται από τέσσερα ωοθηκάρια, καθένα εκ των οποίων περιλαμβάνει μια αλυσίδα ωοθυλακίων, σε προοδευτικά στάδια ανάπτυξης. Υπολογίζεται ότι κάθε ωοθηκάριο περιλαμβάνει πάνω από 100 ωοθυλάκια σε γραμμική διευθέτηση, με το καθένα να αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό αναπτυξιακό στάδιο, διαφέροντας από τα γειτονικά του κατά περίπου 2-2.5 ώρες του αναπτυξιακού προγράμματος. Με βάση μια σειρά μορφογενετικών κριτηρίων, η ανάπτυξη των ωοθυλακίων έχει διαιρεθεί σε δώδεκα διακριτά στάδια. Κάθε ωοθυλάκιο αποτελείται από οκτώ κύτταρα της γαμετικής σειράς και περιβάλλεται από ένα μονόστιβο επιθήλιο κυττάρων μεσοδερμικής προέλευσης, που ονομάζονται θυλακοκύτταρα. Στα κύτταρα της γαμετικής σειράς διακρίνεται ένα ωοκύτταρο και επτά τροφοκύτταρα, τα οποία τροφοδοτούν το ωοκύτταρο με μητρικά RNAs, πρωτεΐνες και οργανίδια. Στο Κολεόπτερο Adalia bipunctata, η ανάπτυξη των ωοθηκών πραγματοποιείται επίσης, κατά το αναπτυξιακό στάδιο της νύμφης, καθώς και κατά τη διάρκεια του μεταβατικού σταδίου, από νύμφη σε ενήλικο άτομο. Οι ωοθήκες των θηλυκών εντόμων ανήκουν στον τελοτροφικό μεροϊστικό τύπο. Σε αυτό τον τύπο ωοθηκών, τα κύτταρα της γαμετικής σειράς που έχουν προγραμματιστεί να διαφοροποιηθούν σε τροφοκύτταρα δεν συνοδεύουν τα ωοκύτταρα στην κίνησή τους προς τη βάση του ωοθηκαρίου, όπως συμβαίνει στον πολυτροφικό μεροϊστικό τύπο ωοθηκών. Αντίθετα, παραμένουν στο γερμάριο, σχηματίζοντας το λεγόμενο τροφάριο, το οποίο συνδέεται με τα αναπτυσσόμενα ωοκύτταρα μέσω των τροφικών λώρων. Επομένως, κάθε ωοθήκη αυτού του τύπου αποτελείται από ωοθηκάρια, καθένα από τα οποία περιλαμβάνει ένα τροφάριο, στο οποίο εντοπίζονται μερικές εκατοντάδες ή και χιλιάδες τροφοκύτταρα. Τα τροφοκύτταρα, μέσα στο τροφάριο, δημιουργούν συσσωματώματα, τα οποία και ακολουθούν μια γραμμική διάταξη, με αποτέλεσμα να οργανώνονται σε σειρές. Ανάμεσα στα τροφοκύτταρα εντοπίζονται κύτταρα σωματικής προέλευσης, τα οποία σχηματίζουν ένα χαλαρό δίκτυο. Κάθε συσσωμάτωμα τροφοκυττάρων είναι παράλληλο ως προς τον κατακόρυφο άξονα του τροφαρίου και καταλήγει σε ένα ωοκύτταρο, στη βάση του ωοθηκαρίου. Τα ωοκύτταρα περιβάλλονται από κύτταρα της σωματικής σειράς, τα οποία ονομάζονται θυλακοκύτταρα. Κάθε ωοθηκάριο μπορεί να περιλαμβάνει από 1 έως 4 ωοκύτταρα, καθένα από τα οποία συνδέεται με μια ομάδα τροφοκυττάρων, μέσω ενός τροφικού λώρου. Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, συνιστά ένα φυσιολογικό μηχανισμό ανάπτυξης και μορφογένεσης πολλών διαφορετικών ιστών. Αποτελεί μια εξελικτικά συντηρημένη κυτταρική λειτουργία, που συναντάται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς, από το Νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans, έως τον άνθρωπο. Σύγχρονες μελέτες υποδεικνύουν ότι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος μπορεί να διακριθεί σε δύο τύπους, στην απόπτωση και στον αυτοφαγικό κυτταρικό θάνατο. Οι κυριότερες μορφολογικές αλλοιώσεις των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση περιλαμβάνουν τη συμπύκνωση της χρωματίνης του κυτταρικού πυρήνα, το θρυμματισμό του πυρηνικού DNA σε θραύσματα διαφορετικών μεγεθών, τη δημιουργία οπών μεγάλης διαμέτρου στις μεμβράνες των μιτοχονδρίων, την εμφάνιση χαρακτηριστικών προεξοχών στην κυτταρική μεμβράνη και το σχηματισμό φαγοσωμάτων, τα οποία περιέχουν κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υπολείμματα. Όλα τα νεκρά κύτταρα απομακρύνονται ταχύτατα με τη μορφή φαγοσωμάτων από γειτονικά μακροφάγα ή επιθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα να προστατεύονται οι παρακείμενοι ιστοί από πιθανές φλεγμονές και άλλες καταστροφικές αλλοιώσεις. Αντίθετα, κατά τη διάρκεια του αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου, το περιεχόμενο του κυττάρου εγκλείεται σε αυτοφαγικά σωμάτια και καταστρέφεται από τα ίδια του τα λυσοσώματα. Ο αριθμός και το μέγεθος των αυτοφαγικών σωματίων αυξάνεται σταδιακά, το κύτταρο συρρικνώνεται και το κυτταρικό περιεχόμενο εμφανίζει αυξημένη ηλεκτρονιοπυκνότητα. Η χρωματίνη είτε υφίσταται συμπύκνωση προς το τέλος του φαινομένου, είτε δεν συμπυκνώνεται καθόλου. Σε πολλές περιπτώσεις, ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος πραγματοποιείται στο ίδιο σύστημα, τόσο μέσω απόπτωσης, όσο και μέσω αυτοφαγίας. Οι πρωτεΐνες τελεστές του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου ονομάζονται κασπάσες και συνιστούν μια συντηρημένη εξελικτικά οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεασών. Διακρίνονται (α) από την παρουσία κυστεΐνης στο ενεργό τους κέντρο και (β) από την υψηλή συγγένεια σύνδεσης με κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος στα υποστρώματα στόχους. Οι κασπάσες ανιχνεύονται σε ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών κυτταρικών τύπων με τη μορφή πρόδρομων ανενεργών προ-ενζύμων. Η μετατροπή του προ-ενζύμου της κασπάσης σε καταλυτικά ενεργό ένζυμο, δια μέσου εκλεκτικής πρωτεόλυσης, αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα γεγονότα έναρξης της απόπτωσης. Η εκλεκτική συμμετοχή διαφορετικών μελών της οικογένειας των κασπασών στις κυτταρικές διαδικασίες της απόπτωσης ανιχνεύεται δια μέσου της χρήσης ειδικών, in vitro συντιθέμενων, αναστολέων της λειτουργίας των ενεργοποιημένων κασπασών (Ac - DEVD - CHO και zVAD - fmk). Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση των ενδοκυτταρικών μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στο Λεπιδόπτερο Bombyx mori και στο Κολεόπτερο Adalia bipunctata. Η προσέγγιση του συγκεκριμένου στόχου όσον αφορά στην απόπτωση πραγματοποιήθηκε, τόσο μέσω της διερεύνησης της in vivo συμμετοχής ενεργοποιημένων κασπασών στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια της ωογένεσης, όσο και μέσω της ανίχνευσης και ταυτοποίησης των μορφολογικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης. Η διερεύνηση του αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου επικεντρώθηκε στην ανίχνευση και στη μετέπειτα ταυτοποίηση της παρουσίας αυτοφαγικών σωματίων και πραγματοποιήθηκε μέσω της χρώσης των ωοθυλακίων με MDC και της περαιτέρω μελέτης τους μέσω φωτονικής και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Η μορφολογική μελέτη των ωοθυλακίων του Λεπιδοπτέρου Bombyx mori πραγματοποιήθηκε μέσω της έγκλεισης ωοθυλακίων κατάλληλων αναπτυξιακών σταδίων σε εποξεικές ρητίνες και επακόλουθης παρατήρησης με τη βοήθεια φωτονικού και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Διαπιστώθηκε ότι οι πυρήνες των τροφοκυττάρων στα ωοθυλάκια αναπτυξιακού σταδίου 8 χαρακτηρίζονται από την παρουσία συμπυκνωμένης χρωματίνης και εμφανίζουν σφαιρική μορφή, σε αντίθεση με τους πυρήνες των τροφοκυττάρων μικρότερων αναπτυξιακών σταδίων, οι οποίοι εμφανίζουν έντονα λοβωτή μορφή, χωρίς συμπυκνωμένη χρωματίνη. Επίσης, κατά το αναπτυξιακό στάδιο 10 είναι ορατή η παρουσία αποπτωτικών σωματίων και η επακόλουθη φαγοκύτωσή τους από τα γειτονικά θυλακοκύτταρα, η οποία καταλήγει στο σχηματισμό φαγοσωμάτων. Για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των μορφολογικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης στο έντομο Β. mori πραγματοποιήθηκε χρώση των ωοθυλακίων με πορτοκαλί της ακριδίνης και ανάλυση με τη μέθοδο TUNEL, ώστε να ανιχνευθεί το θρυμματισμένο γονιδιωματικό DNA. Η χρώση των ωοθυλακίων με πορτοκαλί της ακριδίνης οδήγησε στον εντοπισμό αποδομημένου DNA στον πυρήνα των τροφοκυττάρων ωοθυλακίων αναπτυξιακών σταδίων 8 έως 10 (θετική αντίδραση ακριδίνης), χωρίς αντίστοιχη ένδειξη στα μικρότερα αναπτυξιακά στάδια. Η μέθοδος TUNEL δεν οδήγησε σε ανίχνευση θετικού σήματος σε κανένα αναπτυξιακό στάδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι το DNA στον Β. mori θρυμματίζεται σε κομμάτια υψηλού μοριακού βάρους, τα οποία δεν ανιχνεύονται με τη μέθοδο αυτή. Με σκοπό τη διερεύνηση του προτύπου κατανομής της ακτίνης στα ωοθυλάκια του λεπιδοπτέρου Bombyx mori πραγματοποιήθηκε χρώση των ωοθυλακίων με φαλλοϊδίνη συνδεδεμένη με ροδαμίνη. Διαπιστώθηκε ότι τα μικρά αναπτυξιακά στάδια παρουσιάζουν μια υποφλοιώδη κατανομή της ακτίνης, τόσο στα τροφοκύτταρα όσο και στο ωοκύτταρο, η οποία διατηρείται και στα επόμενα στάδια, καταλήγοντας στο σχηματισμό σφαιρικών δομών που, πιθανότατα, αντιπροσωπεύουν τα αποπτωτικά σωμάτια. Προκειμένου να ερευνηθεί η πραγματική συμμετοχή και συμβολή των κασπασών στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο των τροφοκυττάρων στα τελευταία στάδια της ωογένεσης, χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας VAD-FMK συνδεδεμένος με φθορίζουσα ουσία, ο οποίος εμφανίζει ειδική και υψηλή συγγένεια σύνδεσης με όλες σχεδόν τις κασπάσες. Κανένα θετικό σήμα ενεργούς κασπάσης δεν ανιχνεύθηκε σε τροφοκύτταρα ωοθυλακίων μικρών αναπτυξιακών σταδίων, ενώ κατά τη διάρκεια των σταδίων 8 και 9 ανιχνεύθηκε θετικό σήμα μέσω του VAD-FMK αναστολέα, το οποίο αφορούσε στη γενική ενεργοποίηση του συνόλου των κασπασών. Προκειμένου να διερευνηθεί η συμμετοχή του αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου στη φυσιολογική ωρίμανση των ωοθυλακίων κατά τη διάρκεια της ωογένεσης πραγματοποιήθηκε χρώση των ωοθυλακίων με MDC (mono-dansyl-cadaverine), δηλαδή ενός δείκτη που επιτρέπει την in vivo ανίχνευση αυτοφαγικών σωματίων. Η μορφολογική μελέτη των ωοθυλακίων με τη βοήθεια φωτονικού και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, σε συνδυασμό με τη χρώση ανίχνευσης αυτοφαγικών κυστιδίων MDC, οδήγησε στην διαπίστωση ότι, κατά τα αναπτυξιακά στάδια 5-6 της ωογένεσης, εμφανίζονται αυτοφαγικά κυστίδια στο κυτταρόπλασμα των τροφοκυττάρων των ωοθυλακίων, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου. Όλα τα παραπάνω στοιχεία αποτελούν χαρακτηριστικά του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου τόσο μέσω απόπτωσης, όσο και μέσω αυτοφαγίας και οδηγούν στο συμπέρασμα ότι στα τροφοκύτταρα των ωοθυλακίων του λεπιδοπτέρου Bombyx mori συνυπάρχουν οι δύο μηχανισμοί, με απώτερο στόχο την ομαλή και φυσιολογική ωρίμανση των ωοθυλακίων. Η μορφολογική μελέτη των ωοθυλακίων του Κολεοπτέρου Adalia bipunctata πραγματοποιήθηκε, αντίστοιχα, μέσω της έγκλεισης ωοθυλακίων κατάλληλης ηλικίας (10, 20, 25 και 30 ημερών) σε εποξεικές ρητίνες και της παρατήρησής τους με τη βοήθεια φωτονικού μικροσκοπίου. Διαπιστώθηκε ότι οι πυρήνες των τροφοκυττάρων στο τροφάριο των ωοθυλακίων ηλικίας 10 και 20 ημερών εμφανίζονται φυσιολογικοί, χωρίς συμπυκνωμένη χρωματίνη, σε αντίθεση με εκείνους στο τροφάριο ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 25 και 30 ημερών, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την παρουσία συμπυκνωμένης χρωματίνης και εμφανίζουν σφαιρική μορφή. Επίσης, κατά τις ίδιες ηλικίες (25 και 30 ημέρες ανάπτυξης) είναι ορατή η παρουσία αποπτωτικών σωματίων στα τροφάρια των ωοθυλακίων και η επακόλουθη φαγοκύτωση τους από τα γειτονικά θυλακοκύτταρα, η οποία καταλήγει στο σχηματισμό φαγοσωμάτων. Η συμπύκνωση της χρωματίνης στους πυρήνες των ωοθυλακίων παρατηρείται σε μεγαλύτερο ποσοστό στα τροφάρια των ωοθυλακίων που προέρχονται από έντομα ηλικίας 30 ημερών. Η χρώση των ωοθυλακίων με πορτοκαλί της ακριδίνης οδήγησε στον εντοπισμό αποδομημένου DNA στον πυρήνα των τροφοκυττάρων ωοθυλακίων που προέρχονται από έντομα ηλικίας 25 και 30 ημερών (θετική αντίδραση ακριδίνης). Σε τροφάρια ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 10 και 20 ημερών, η χρώση με πορτοκαλί της ακριδίνης αποκαλύπτει μια σποραδική παρουσία αποδομημένου DNA στους πυρήνες των τροφοκυττάρων, σε πολύ μικρότερο ποσοστό από το αντίστοιχο στα ωοθυλάκια εντόμων ηλικίας 25 και 30 ημερών. Η δοκιμασία ανίχνευσης ενεργοποιημένων κασπασών με τη βοήθεια του αναστολέα VAD-fmk (Red-VAD-fmk και Fitc-VAD-fmk) αποκάλυψε ότι στα τροφοκύτταρα των ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 25 και 30 ημερών εντοπίζονται ενεργοποιημένες κασπάσες, με υψηλότερο ποσοστό θετικής αντίδρασης στα τροφοκύτταρα εντόμων ηλικίας 30 ημερών. Αντίθετα, στα τροφοκύτταρα των ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 10 και 20 ημερών το φαινόμενο είναι σποραδικό, σε πολύ μικρό ποσοστό και η πλειοψηφία των τροφαρίων δεν δίνει θετική αντίδραση VAD-fmk. Με τη βοήθεια της πυρηνικής χρωστικής DAPI διαπιστώθηκε η συμπύκνωση της χρωματίνης των πυρήνων σε τροφοκύτταρα ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 25 και 30 ημερών, γεγονός που δεν παρατηρείται σε τροφοκύτταρα ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 10 και 20 ημερών. Οι ίδιες παρατηρήσεις ισχύουν για τη χρώση των ωοθυλακίων με τη χρωστική Propidium Iodide. Το ποσοστό συμπύκνωσης χρωματίνης των πυρήνων τροφοκυττάρων είναι υψηλότερο σε έντομα ηλικίας 30 ημερών. Η μορφολογική μελέτη των ωοθυλακίων με τη βοήθεια φωτονικού και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, σε συνδυασμό με τη χρώση ανίχνευσης αυτοφαγικών κυστιδίων MDC, οδήγησε στη διαπίστωση ότι εμφανίζονται αυτοφαγικά κυστίδια στο κυτταρόπλασμα των τροφοκυττάρων ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 25 και 30 ημερών, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου κατά την ωογένεση. Αντίθετα, στο κυτταρόπλασμα των τροφοκυττάρων ωοθυλακίων εντόμων ηλικίας 10 και 20 ημερών δεν διαπιστώθηκε παρουσία αυτοφαγικών κυστιδίων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα τροφάρια ωοθυλακίων εντόμων μεγαλύτερης ηλικίας του Κολεοπτέρου Adalia bipunctata, που πλησιάζουν προς το τέλος της αναπαραγωγικής τους περιόδου (25 και 30 ημερών), εμφανίζουν τα τυπικά χαρακτηριστικά του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (συμπύκνωση και κατακερματισμό χρωματίνης, παρουσία ενεργοποιημένων κασπασών, παρουσία αποπτωτικών σωματίων και αυτοφαγικών κυστιδίων), γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου κατά την ωογένεση, με σκοπό τη φυσιολογική ανάπτυξη των ωοθυλακίων και το ενεργειακό κέρδος για τον οργανισμό. Αντίθετα, τα τροφάρια ωοθυλακίων εντόμων μικρότερης ηλικίας του κολεοπτέρου Adalia bipunctata (10 και 20 ημερών), εμφανίζουν σποραδικά και σε πολύ μικρό ποσοστό τα τυπικά χαρακτηριστικά του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, γεγονός που υποδηλώνει ότι σε αυτές τις ηλικίες τα τροφοκύτταρα παραμένουν ενεργά, προκειμένου να συνεχίζεται η ομαλή ανάπτυξη των ωοκυττάρων κατά την αναπαραγωγική περίοδο της ζωής των εντόμων. Η σποραδική εμφάνιση των χαρακτηριστικών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου μπορεί να ερμηνευθεί είτε ως τυχαίο γεγονός, είτε ως προσπάθεια του οργανισμού να καταστρέψει κάποια μη λειτουργικά τροφοκύτταρα (ανώμαλα), προκειμένου να εξασφαλιστεί η ομαλή ανάπτυξη των ωοθυλακίων. Επιπλέον, όλα τα παραπάνω στοιχεία συνηγορούν υπέρ της άποψης ότι, όπως συμβαίνει στα δίπτερα έντομα, στο Λεπιδόπτερο Bombyx mori και στο Κολεόπτερο Adalia bipunctata ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος κατά την ωογένεση πραγματοποιείται τόσο μέσω απόπτωσης, όσο και μέσω αυτοφαγίας και οδηγούν στο συμπέρασμα ότι στα τροφοκύτταρα των ωοθυλακίων των παραπάνω εντόμων συνυπάρχουν οι δύο μηχανισμοί, με απώτερο στόχο την ομαλή και φυσιολογική ωρίμανση των ωοθυλακίων.