Μοριακοί μηχανισμοί ρύθμισης της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης

Abstract

Soluble guanylate cyclase (sGC) is an important downstream intracellular target of the nitric oxide (NO). When sGC is activated, it converts GTP to the second messenger cGMP contributing to vasorelaxation, platelet aggregation, angiogenesis, vascular remodeling and synaptic transmission. In the present study, we investigated two aspects of the molecular regulation of the most common heterodimeric form of sGC (α1β1): 1) sGC regulation by Heat shock protein 90 (Hsp90) and 2) regulation by Reactive Oxygen Species (ROS). With respect to the first part of our study, after verifying the interaction of the two proteins, we demonstrated that both the α1 and β1 sGC subunits are able to bind Hsp90. Characterization of the region of Hsp90 required to bind the β1 subunit in in vitro binding assays revealed that residues 237 to 628 were involved in the interaction. The region of β1 responsible for binding Hsp90 was demonstrated to not include the first 100 amino acids of the subunit. The physiological importance of the sGC/Hsp90 interaction was investigated by treating rat aortic smooth muscle cells with the Hsp90 inhibitors geldanamycin (GA) and radicicol (RAD) and determining both sGC activity and protein levels. Long-term (24 or 48 hrs) inhibition of Hsp90 resulted in a strong decrease of both α1 and β1 protein levels and sGC activity. In addition, incubation of the same type of cells with the proteasome inhibitor N-benzoyloxycarbonyl (Z)-Leu-Leu-leucinal (MG-132) blocked the GA-induced down-regulation of sGC, suggesting that the disruption of the sGC/Hsp90 complex renders the sGC subunits prompt to proteasomal degradation. With respect to the second part of this study, we demonstrated that long-term (12 and 24 hrs) exposure of rat aortic smooth muscle cells to hydrogen peroxide (H2O2) and the ROS-releasing agents xanthine/xanthine oxidase (X/XO) and menadione sodium bisulfite (MSB), resulted in a strong decrease of both the α1 and β1 protein levels and the SNP-stimulated cGMP accumulation. Furthermore, we showed that platelet-derived Growth Factor (PDGF) had similar down-regulatory effects on the protein levels of the sGC subunits, that could be prevented by pretreatment with the anti-oxidant N-acetyl-cysteine (NAC), suggesting that endogenously produced ROS are capable of inhibiting sGC expression. Exposure of rat aortic smooth muscle cells to the proteasomal inhibitor MG-132 had no effect on the ROS-induced down-regulation of sGC, suggesting that ROS decrease sGC protein levels and activity in a manner independent of the proteasomal degradation pathway. In an effort to identify a mechanism responsible for the actions of ROS on sGC, we also examined the involvement of the c-Jun N-terminal kinases (JNKs) and the protein tyrosine kinases in the phenomenon observed. Using inhibitors of the above kinases, we demonstrated that ROS’ effects on sGC are not facilitated through any of the two types of kinases. Finally, we demonstrated that long-term exposure of rat aortic smooth muscle cells to H2O2 also caused a decrease in the mRNA levels of α1 (by 68%), which was accompanied by a reduction in the α1 promoter-driven luciferase activity. This observation along with the fact that rat aortic smooth muscle cells exposed to H2O2 also exhibited reduced levels of the mRNA-stabilizing protein Human Antigen R (HuR), suggested that ROS down-regulate sGC through inhibition of transcription and the destabilization of sGC subunits’ mRNA. We conclude, that both the exogenously added, as well as the endogenously produced ROS trigger the down-regulation of sGC protein and activity and that that is due to a reduction in steady state sGC mRNA. To sum up, in the present thesis we showed the regulation of sGC at the post-translational level by Hsp90 and at the transcriptional and post-transcriptional level by ROS. In both cases, regardless the underlying molecular mechanism, the final outcome was the alteration of the cells’ physiological ability to respond to NO. This is indicative of the fact that the cell possesses and utilizes many different and often opposing mechanisms to regulate one single molecule, in order to promptly and effectively respond to any given stimulus at any given time.

Η διαλυτή Γουανυλική Kυκλάση (δΓΚ) αποτελεί τον κύριο, ενδοκυττάριο υποδοχέα του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Όταν η δΓΚ διεγείρεται, καταλύει την μετατροπή της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) σε κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη (cGMP) και μέσω αυτής συμμετέχει σε μια πληθώρα διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων της αγγειακής χάλασης, της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, της αγγειογένεσης, του ανασχηματισμού των αγγείων και της συναπτικής μετάδοσης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε δύο πτυχές της μοριακής ρύθμισης της δΓΚ: 1) την ρύθμιση της από την πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (heat shock protein 90 - Hsp90) και 2) την ρύθμιση της από τις Δραστικές Μορφές Οξυγόνου (ΔΜΟ), των οποίων αυξημένα επίπεδα σε πολλές παθοφυσιολογικές καταστάσεις έχουν συνδεθεί με διαταραχές του μονοπατιού ΝΟ/cGMP. Όσον αφορά το πρώτο μέρος της διατριβής, αφού επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών, δείξαμε στη συνέχεια πως και οι δυο υπομονάδες της δΓΚ, α1 και β1, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν με την Hsp90. Επιπλέον, με πειράματα in vitro ανάλυσης πρόσδεσης εντοπίσαμε τη περιοχή της Hsp90 που ευθύνεται για την πρόσδεση της στην β1 υπομονάδα στα κατάλοιπα 237 έως 628 της Μ περιοχής της, ενώ για τη περιοχή μέσω της οποίας η β1 υπομονάδα αλληλεπιδρά με την Hsp90 δείξαμε ότι αυτή δεν περιλαμβάνει τα πρώτα 100 αμινοξέα της υπομονάδας. Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης της Hsp90 με την δΓΚ μελετήθηκε επωάζοντας λεία μυϊκά κύτταρα αορτής αρουραίων (RASM) με τους αναστολείς της Hsp90 γελνταναμυκίνη (GA) και ραντισικόλη (RAD) και προσδιορίζοντας τόσο τα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων της δΓΚ, όσο και τη παραγωγή cGMP από αυτήν. Η μακράς διάρκειας (24 ή 48 ώρες) αναστολή της Hsp90 είχε σαν αποτέλεσμα την δραστική μείωση των επιπέδων και των α1 και β1 υπομονάδων και της cGMP. Επιπλέον, η επώαση του ίδιου τύπου κυττάρων με τον αναστολέα του πρωτεοσώματος MG-132 ανέστρεψε πλήρως την επίδραση της GA στη δΓΚ, υποδηλώνοντας ότι η διαταραχή του δΓΚ/Ηsp90 συμπλόκου καθιστά τις υπομονάδες της δΓΚ ευάλωτες στην πρωτεοσωμική αποικοδόμηση. Συμπερασματικά, αποδείξαμε πως η πρόσδεση της Ηsp90 στη δΓΚ ρυθμίζει τον αριθμό των διαθέσιμων ενεργών ενζύμων, επηρεάζοντας τα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων. Όσον αφορά το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, δείξαμε πως η μακράς διάρκειας (12 και 24 ώρες) έκθεση RASM κυττάρων στο υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) και στους παράγοντες απελευθέρωσης ΔΜΟ ξανθίνη/οξειδάση της ξανθίνης (Χ/ΧΟ) και νατριούχο θειώδες άλας της μεναδιόνης (ΜSB), είχε σαν αποτέλεσμα την δραστική μείωση τόσο των α1 και β1 πρωτεϊνικών επιπέδων, όσο και της από το SNP επαγόμενης συσσώρευσης της cGMP. Επιπλέον, δείξαμε ότι ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας (PDGF) έχει παρόμοια επίδραση αρνητικής ρύθμισης στα πρωτεϊνικά επίπεδα της δΓΚ με αυτή που παρατηρήθηκε προηγουμένως από τις ΔΜΟ και επιβεβαιώσαμε πως η δράση του PDGF είναι εξαρτώμενη από τις τελευταίες. Η έκθεση των RASM κυττάρων στους αναστολείς του πρωτεοσώματος ΜG-132 και λακτακυστίνη δεν επηρέασε την ελάττωση της δΓΚ από τις ΔΜΟ, υποδηλώνοντας πως η επίδραση των τελευταίων στα πρωτεϊνικά επίπεδα των δύο υπομονάδων της δΓΚ και στην ενεργότητα της μεσολαβούνται από μηχανισμούς ανεξάρτητους του πρωτεοσώματος. .............................................................................................................................