Δομική και λειτουργική μελέτη της περιοχής BRCT της πρωτεΐνης BRCA1.: Επίδραση παθογόνων μεταλλάξεων στην πρόσδεση άλλων πρωτεϊνών

Abstract

Several germ-line mutations in the human BRCA1 gene are known to be associated with inherited breast and ovarian cancer. Most of them are frameshift of nonsense mutations resulting in a truncated protein easily assigned as deleterious mutations. However, a large number of missense mutations have been identified and although their functional role in carcinogenesis remains to be determined, a handful have already been linked to the pathological phenotype. Up to very recently only six missense mutations at the C-terminal domain of BRCA1 (BRCT) have been associated to cancer. On the other hand, over one hundred missense mutations have been deposited at Breast Cancer Information Core (BIC) as unclassified variants although functional studies have shown that several lead to loss of function in vitro. A part of them has been identified, by our group, in Greek patients with family history of breast/ovarian cancer. The BRCT repeats consist of 95 - 100 residues. They are encountered in a multitude of proteins of different apparent functions as single, tandem or multiple (as many as eight repeats). The crystal structures of the tandem BRCT repeats (each containing ~90 aminoacids) comprising the C-terminal functional BRCT domain of BRCA1 as well as of 53BP1, reveal a common structural motif, which is highly conserved among BRCT repeats. It consists of a parallel four-stranded β-sheet located at the central part of the fold surrounded by three α-helices. The two BRCT repeats pack together in a specific head to-tail manner, giving rise to the formation of a conserved, almost all-hydrophobic inter-repeat interface. A flexible, BRCTrepeat-interconnecting, 23-residue linker is also involved in the interface formation since the α-helix at its center packs right against the inter-BRCT interface. The structural integrity of the tandem repeats is essential for the molecule's interaction with phosphorylated protein targets including the DNA helicase BACH1 and the CtBP-interacting protein CtIP. The crystal structure of the BRCT complex with the phosphopeptides containing the sequence pSer-X-X-Phe, (phosphorylation of Ser990 and Ser327 for the BACH1 and CtIP phosphopetides respectively, X stands for any residue) revealed that phosphoserine binds at a conserved pocket at the N-terminal BRCT repeat while the hydrophobic groove at the inter-BRCT interface region recognizes phenylalanine. Missense mutations at the BRCT domain of human BRCA1 protein have been associated with an elevated risk for hereditary breast/ovarian cancer. They have been shown to affect the binding site and they have also been proposed to affect domain stability, severely hampering the protein's tumor suppressor function. In order to assess the impact of various such mutations upon the stability and the function of the BRCT domain, heat-induced denaturation has been employed to study the thermal unfolding of variants M1775R and R1699W, which have been linked with the disease, as well as of V1833M, which has been reported for patients with a family history. The mutation M1775R has already been shown to induce subtle structural alteration only at the site of substitution with no impact upon the integrity of the overall BRCT domain structure. Based on the calorimetric results presented here, it has the most severe effect upon the thermostability of the BRCT domain with respect to the thermally unfolded intermediate state. This, combined with the fact that the guanidinium group of Arg1775 obstructs Phe (+3) of the phosphopeptide pSer-X-X-Phe motif (of BACH1 and CtIP proteins) from accessing the binding pocket, renders this mutation capable of inactivating the BRCT domain and thus disease predisposing. ................................................................

Ένας σημαντικός αριθμός μεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA1 συσχετίζονται άμεσα με την εμφάνιση κληρονομικού καρκίνου μαστού/ωοθηκών. Οι περισσότερες από αυτές έχουν ώς αποτέλεσμα η τελική πρωτεΐνη να είναι μικρότερη της φυσιολογικής με συνέπεια να χαρακτηρίζονται ως παθογόνες εξ ορισμού. Ένας μεγάλος αριθμός παρανοηματικών μεταλλάξεων έχουν αναφερθεί δίχως όμως να έχει διευκρινισθεί ο ρόλος τους στην καρκινογένεση. Μέχρι πρόσφατα μόνο έξι παρανοηματικές μεταλλάξεις στη καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης BRCA1 (BRCT) έχουν συσχετισθεί με τον καρκίνο μαστού/ωοθηκών. Από την άλλη περισσότερες από εκατό παρανοηματικές μεταλλάξεις έχουν κατατεθεί στη διεθνή βάση δεδομένων BIC χωρίς να υπάρχουν αρκετά στοιχεία ώστε να χαρακτηριστούν παθογόνοι αν και λειτουργικές μελέτες έχουν δείξει ότι αρκετές από αυτές οδηγούν σε απώλεια της λειτουργικότητας in vitro. Τέτοια παραδείγματα έχουν αναφερθεί και από την ομάδα μας και αφορούν Έλληνες ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό καρκίνου μαστού/ωοθηκών. Οι επαναλήψεις BRCT αποτελούνται από 95-100 αμινοξικά κατάλοιπα και απαντώνται σε διάφορες πρωτεΐνες ως μονές ή πολλαπλές επαναλήψεις. Η κρυσταλλική δομή της περιοχής BRCT της πρωτεΐνης BRCA1 καθώς και άλλων ανάλογων πρωτεϊνών, όπως η 53BP1, ανέδειξε ένα κοινό δομικό μοτίβο το οποίο είναι υψηλά συντηρημένο σε πρωτεΐνες που φέρουν την επανάληψη αυτή. Αποτελείται από τέσσερα αντιπαράλληλα β-πτυχωτά φύλλα τα οποία περιβάλλονται από τρείς α-έλικες. Οι δύο επαναλήψεις BRCT πακετάρονται και προσανατολίζονται με τέτοιο τρόπο που οδηγεί στο σχηματισμό μιας υδρόφοβης διεπιφάνειας. Στη δημιουργία αυτής της διεπιφάνειας συμβάλλει επίσης και η ευκίνητη α-έλικα που συνδέει τις δύο επαναλήψεις BRCT. Η δομική ακεραιότητα της περιοχής BRCT είναι καθοριστική για την αλληλεπίδραση της με φωσφορυλιωμένους πρωτεϊνικούς στόχους όπως η ελικάση BACH1 και η πρωτεΐνη CtIP. Η κρυσταλλική δομή των συμπλόκων της πρωτεΐνης BRCT με τα φωσφοπεπτίδια της BACH1 και CtIP που φέρουν το μοτίβο pSer-X-X-Phe, ανέδειξε ότι η φωσφορυλιωμένη σερίνη συνδέεται σε μια συντηρημένη περιοχή στο αμινοτελικό BRCT και η φαινυλαλανίνη σε μια κοιλότητα στην υδρόφοβη διεπιφάνεια μεταξύ των δύο BRCT. Με βάση την παγκόσμια βάση δεδομένων γενετικών αναλύσεων, έχουν αναφερθεί παρανοηματικές μεταλλάξεις στον τομέα BRCT της BRCA1 που σχετίζονται με τον κληρονομικό καρκίνο μαστού και ωοθηκών και στις οποίες περιλαμβάνονται οι μεταλλάξεις M1775R και R1699W. Η μετάλλαξη M1775R φαίνεται να προκαλεί μόνο τοπικές δομικές μεταβολές στην περιοχή της αντικατάστασης της μεθειονίνης χωρίς να επηρεάζει τη δομική ακεραιότητα της περιοχής BRCT. Λαμβάνοντας υπόψη τα θερμιδομετρικά αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, η μετάλλαξη αυτή παρουσιάζει τα πιο δραματικά αποτελέσματα όσον αναφορά τη θερμοσταθερότητα της περιοχής BRCT κατά τη μετάβαση στην ενδιάμεση μερικώς αποδιαταγμένη κατάσταση. Επιπρόσθετα, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η γουανιδική ομάδα της αργινίνης στη θέση 1775 παρεμποδίζει τη φαινυλαλανίνη (+3) του φωσφοπεπτιδίου με μοτίβο pSer-X-X-Phe (των πρωτεϊνών BACH1 και CtIP) στο να έχει πρόσβαση στη θέση σύνδεσης, καθιστούν αυτή τη μετάλλαξη ικανή στο να απενεργοποιεί την περιοχή BRCT και κατά συνέπεια να σχετίζεται άμεσα με την ασθένεια. ..........................................................................