Ανάλυση των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 σε ελληνικές οικογένειες με ιστορικό καρκίνου μαστού - ωοθηκών: συσχέτιση του ρόλου των μεταλλάξεων με τη δομή και τη λειτουργία της πρωτεΐνης BRCA1

Abstract

Almost 30% of the total cases of breast cancer occurs in families with a positive history towards the disease (familial cancer), whereas the 70% occur in the absence of other cases (sporadic cancer). One third of the familial cancer cases can be attributed to mutations of certain genes (hereditary breast cancer syndrome). Mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes predispose to hereditary breast and ovarian cancer. Our goal was to unravel the mutational spectrum of the BRCA1 and BRCA2 genes in Greek patients with family history of breast/ovarian cancer. Genomic DNA was purified from blood samples of 87 patients and it was screened using the Polymerase Chain Reaction and Direct DNA Sequencing. Deleterious mutations were identified in fifteen patients (~17%). Those mutations were also identified in all relatives-patients when samples were available. Eight of these families were carriers of BRCA1 mutations, whilst the remaining seven families were carriers of BRCA2 mutations. The 5382insC mutation in the BRCA1 gene -which is of high frequency in several East European countries-, has been found in four non-related families indicating an elevated frequency in the Greek population. Moreover, the mutations R1751X και 5586G>A were found in the BRCA1 gene and the mutations 2024del5, 3058delA, 4147delG, 6024delTA και 6631del5 were found in the BRCA2 gene. Mutations R1751X in the BRCA1 gene and 2024del5 και 4147delG in the BRCA2 gene, also demonstrate an elevated frequency as they have been all found twice in our pool of patients. The role of the mutation 5586G>A -a substitution of the last nucleotide of exon 23 in the BRCA1 gene- in the RNA splicing was further investigated. Total RNA was isolated from peripheral blood lymphocytes and it was used to produce cDNA using the reverse transcription technique. Amplification of the cDNA with specific primers showed that alternative splicing had occurred in the mutated copy of the gene, which would result in the production of a protein that is missing 51 amino acids with the final 10 amino acids different from those in the wild type protein sequence. Given the results, we conclude that exon 20 of the BRCA1 gene is highly variable in the greek population, so we propose that genetic screening of Greek patients should begin with this region. The missense mutation G1738R in the exon 20 of the BRCA1 gene has been found in four non-related families and there is evidence that it could be deleterious. The role of missense mutations, where individual amino acids are replaced, in the structure and function of the protein cannot be easily evaluated. In order to be able to characterize these mutations on a protein level, the carboxy-terminal region of BRCA1 gene -where more than 100 mutations have been identified- was cloned in a suitable vector and the corresponding protein was obtained in a highly soluble and stable form. Using gel filtration it was shown that the protein behaves as a monomer at pH 7.0 and as a dimmer at pH 9.0. Furthermore, the secondary and tertiary structure elements of the protein were analysed with circular dichroism and the thermodynamic stability of the protein was measured using differential scanning calorimetry. Thermal unfolding at pH 9.0 revealed the presence of an intermediate product, which retained its major structural integrity. Further analysis showed that the unfolding step would mainly consist of a repositioning of the two BRCT repeats relative to each other. The experimental results from the study of the wild type BRCA1 protein can be used along with the results that will be obtained from the study of the mutants to determine whether a missense mutation is deleterious or not. In conclusion, these results have set the basis for the establishment of the genetic test in Greek patients with family history of breast and ovarian cancer. Finally, a first step, towards characterizing the impact of missense mutations in the function of the BRCA1 protein, has also been made.

Το 30% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου μαστού και ωοθηκών αποτελεί τον οικογενή καρκίνο, ενώ το υπόλοιπο 70% τον σποραδικό. Περίπου το ένα τρίτο του οικογενούς καρκίνου (~10% επί του συνόλου) αφορά το σύνδρομο του κληρονομικού καρκίνου μαστού και ωοθηκών. Μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 σχετίζονται με το παραπάνω σύνδρομο. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η καταγραφή και ο χαρακτηρισμός των μεταλλάξεων που απαντούν σε Ελληνίδες ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών. Απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από το αίμα 87 ασθενών και με μεθόδους Μοριακής Βιολογίας (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και άμεση ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA) εντοπίστηκαν αδιαμφισβήτητα παθογόνοι μεταλλάξεις σε δεκαπέντε από αυτούς (~17%). Οι μετάλλαξεις αυτές ανιχνεύθηκαν και σε όσους συγγενείς-ασθενείς υπήρχε διαθέσιμο δείγμα. Από τις δεκαπέντε αυτές οικογένειες οι οκτώ είναι φορείς μεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA1 και οι υπόλοιπες επτά στο γονίδιο BRCA2. H μετάλλαξη 5382insC στο γονίδιο BRCA1 -η οποία είναι συχνή σε αρκετές χώρες της Ανατολικής Ευρώπης- βρέθηκε σε τέσσερις οικογένειες μη σχετιζόμενες μεταξύ τους, γεγονός που υποδεικνύει την αυξημένη συχνότητά της και στον ελληνικό πληθυσμό. Επιπλέον, βρέθηκαν οι μεταλλάξεις R1751X και 5586G>A στο γονίδιο BRCA1 και οι 2024del5, 3058delA, 4147delG, 6024delTA και 6631del5 στο γονίδιο BRCA2. Σχετικά αυξημένη συχνότητα φαίνεται να εμφανίζουν και οι μεταλλάξεις R1751X στο γονίδιο BRCA1 και οι 2024del5 και 4147delG στο γονίδιο BRCA2, οι οποίες έχουν βρεθεί από δύο φορές η καθεμιά. Η μετάλλαξη 5586G>A -που έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση του τελευταίου νουκλεοτιδίου του εξωνίου 23 του BRCA1- μελετήθηκε ξεχωριστά ως προς την επίδρασή της στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, απομονώθηκε ολικό RNA από τη φορέα της μετάλλαξης, έγινε η μετατροπή του σε cDNA χρησιμοποιώντας την αντίστροφη μεταγραφάση και βρέθηκε ότι το συμπληρωματικό DNA από το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο είχε υποστεί εναλλακτικό μάτισμα με αποτέλεσμα η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται να είναι κατά 51 αμινοξέα μικρότερη από τη φυσιολογική, ενώ ταυτόχρονα τα τελευταία 10 αμινοξέα είναι διαφορετικά από τα υπάρχοντα στη φυσιολογική BRCA1. Από τα δεδομένα του γενετικού ελέγχου προκύπτει ότι το εξώνιο 20 του γονιδίου BRCA1 εμφανίζει αυξημένη συχνότητα μεταλλάξεων στον ελληνικό πληθυσμό. Για το λόγο αυτό συμπεραίνουμε ότι ο γενετικός έλεγχος των Ελλήνων ασθενών θα πρέπει να ξεκινά από την περιοχή αυτή. Η παρανοηματική μετάλλαξη G1738R στο εξώνιο 20 του BRCA1 έχει βρεθεί σε τέσσερις οικογένειες μη σχετιζόμενες μεταξύ τους και τα μέχρι στιγμής δεδομένα συνηγορούν υπέρ του χαρακτηρισμού της ως παθογόνου. Οι σημειακές μεταλλάξεις που επιφέρουν αντικατάσταση ενός αμινοξέος κατά κανόνα δεν μπορούν να αξιολογηθούν άμεσα ως προς την παθογένεια. Προκειμένου να καταστεί δυνατός στο μέλλον ο χαρακτηρισμός τέτοιων μεταλλάξεων σε λειτουργικό επίπεδο έγινε η κλωνοποίηση της καρβοξυτελικής περιοχής (περιοχή BRCT) της πρωτεΐνης BRCA1 -στην οποία παρατηρείται και ο μεγαλύτερος αριθμός σημειακών μεταλλάξεων- σε κατάλληλο φορέα και ακολούθησε η έκφραση της πρωτεΐνης και η απομόνωσή της. Με χρωματογραφία μοριακής διήθησης βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη σε pH 9.0 βρίσκεται κατά 99% υπό τη μορφή διμερούς, ενώ σε pH 7.0 βρίσκεται κυρίως υπό τη μορφή μονομερούς. Επιπλέον, στο πρωτεϊνικό προϊόν έγινε μελέτη δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής με χρήση κυκλικού διχρωισμού και μελέτη της θερμοδυναμικής σταθερότητας με θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης. Μετά από θερμική αποδιάταξη (σε pH 9.0) ήταν δυνατή η απομόνωση ενός ενδιάμεσου προϊόντος, το οποίο διατηρούσε κατά μεγάλο ποσοστό τα στοιχεία της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής του. Περαιτέρω μελέτη του προϊόντος αυτού έδειξε σχετική επαναδιευθέτηση των δύο περιοχών BRCT. Τα αποτελέσματα αυτά βοηθούν στη διασαφήνιση του ρόλου των παρανοηματικών μεταλλάξεων στη δομή και λειτουργία της πρωτεΐνης BRCA1. Τα αποτελέσματα αυτά έθεσαν τις βάσεις για την εγκαθίδρυση του γενετικού τεστ σε Έλληνες ασθενείς με οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών. Επιπλέον, δημιουργήθηκαν οι προϋποθέσεις για την περαιτέρω δομική μελέτη των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 και της πρωτεΐνης BRCA1.