Ανίχνευση και χαρακτηρισμός μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων στα γονίδια brca1 και brca2 σε οικογένειες με κληρονομικό καρκίνο μαστού / ωοθηκών

Abstract

Breast cancer is the most commonly occurring cancer among women and the second leading cause of cancer - related deaths in women in western world. The estimated annual incidence of breast cancer worldwide is about one million cases. Ovarian cancer accounts for 4% of all cancers in women. In 1997, almost 26.700 new cases were diagnosed and almost 14.800 women died of the disease in the United States. An estimated 10% of all breast cancer cases and 8% of all ovarian cancer cases are hereditary. Two breast/ovarian cancer susceptibility genes (BRCA1 and BRCA2) have been mapped and cloned. Early genetic linkage studies using multiple case families have suggested that mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes account for 45% of hereditary breast cancer and 80 - 90% of breast and ovarian cancer. Based on some of these studies, it was determined that BRCA1 mutation carriers had a lifetime risk of 60 - 85% for breast cancer and almost half this percentage for ovarian cancer by the age of 70. For BRCA2 the relevant proportion is the same as for BRCA1 gene concerning the risk of breast cancer development, whereas much smaller concerning ovarian cancer. Moreover, in the case the disease is developed in older patients. The BRCA1 mutational spectrum is very complex and the identification of these mutations has a very important diagnostic value. The presence of genomic rearrangements of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast and/or ovarian cancer families has been intensively investigated in patients from various countries over the last years. Germline genomic rearrangements have been found to be the cause of development of a variety of human genetic disorders, including several cancer - susceptibility syndromes. Since 1997, when the first genomic rearrangement of BRCA1 was described, it has been shown that genomic rearrangements make a significant contribution to the mutation spectrum of BRCA1. The proportion of BRCA1 mutations due to genomic rearrangements ranges in different countries from 4% to 20% except when a founder effect results in a mutated allele with a high frequency. The proportion of BRCA2 mutations due to genomic rearrangements is lower and ranges from 2% to 11%. The purpose of the present work was the identification and characterization of genomic rearrangements in BRCA1 and BRCA2 genes as well as the contribution of those rearrangements in the development of cancer in Greek patients with breast/ovarian cancer. Two different technical approaches were applied: Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent fragments (QMPSF) and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Two different large genomic rearrangements in BRCA1 gene were detected by QMPSF in two unrelated families in a cohort of 112 unrelated families with breast/ovarian cancer history analyzed. The first rearrangement detected includes an approximately 4 kb deletion involving exon 20 of BRCA1 gene, whereas the second one includes an approximately 4.5 kb deletion involving exon 24 and the 3΄- untranslated region of the BRCA1 gene. Those large deletions were confirmed by long - range PCR and characterized by direct sequencing. Both of them are novel. The mutation effect of the 4.5 kb deletion was the complete loss of the mutant transcript. This was found by cSNP genotyping. In order to estimate the frequency of genomic rearrangements in Greek patients with breast/ovarian cancer, diagnostic primers were designed. A number of 86 unrelated families with breast ovarian cancer history and 210 sporadic breast cancer patients were examined using these diagnostic primers. The exon 24 deletion was detected in an additional unrelated family with breast/ovarian cancer history. Moreover, a different exon 20 genomic rearrangement was detected in a sporadic breast cancer patient. This last rearrangement involved a 3.2 kb deletion including exon 20 which has been described once more, also in a Greek patient. Conclusively, the contribution of genomic rearrangements in Greek patients with breast/ovarian cancer accounts for approximately 10% of all BRCA1 mutations. A cohort of 81 unrelated families with breast cancer history was examined for BRCA2 large genomic rearrangements using the technique MLPA. No genomic rearrangements were detected in this case. This last result is in agreement with other population studies (e.g in Netherlands, Germany, Denmark and Finland) where no rearrangements were detected.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνή μορφή καρκίνου στις γυναίκες, καθώς και τη δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου στις γυναίκες του δυτικού κόσμου. Κάθε χρόνο αναφέρονται περίπου ένα εκατομμύριο νέα περιστατικά καρκίνου του μαστού παγκοσμίως. Παράλληλα, ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί το 4% όλων των ειδών καρκίνων στις γυναίκες. Το 1997 περίπου 26.700 νέα περιστατικά διαγνώστηκαν, ενώ περίπου 14.800 γυναίκες κατέληξαν εξαιτίας της συγκεκριμένης νόσου στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Εκτιμάται ότι το 10% περίπου όλων των καρκινωμάτων του μαστού είναι κληρονομούμενο, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τον οικογενή καρκίνο των ωοθηκών εκτιμάται στο 8%. Στον άνθρωπο, έχουν χαρτογραφηθεί και κλωνοποιηθεί δύο γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο μαστού/ωοθηκών, τα BRCA1 και BRCA2. Μελέτες γενετικής σύνδεσης σε οικογένειες με πολλαπλά περιστατικά καρκίνου έδειξαν ότι το 45% των περιπτώσεων κληρονομικού καρκίνου του μαστού και το 80 - 90% των περιπτώσεων κληρονομικού καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών οφείλονται σε μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2. Εκτιμάται ότι φορείς μιας κληρονομούμενης παθογόνου μετάλλαξης στο γονίδιο BRCA1 έχουν 60 - 85% πιθανότητα να αναπτύξουν καρκίνο του μαστού, ενώ στα μισά περίπου επίπεδα κυμαίνονται τα αντίστοιχα ποσοστά που αντιπροσωπεύουν την πιθανότητα να αναπτύξουν καρκίνο των ωοθηκών μέχρι την ηλικία των 70 ετών. Για το γονίδιο BRCA2 τα ποσοστά για τον καρκίνο του μαστού κυμαίνονται περίπου στα ίδια επίπεδα με τα αντίστοιχα στο γονίδιο BRCA1 αν και συνήθως η νόσος εμφανίζεται σε μεγαλύτερη ηλικία, ενώ σημαντικά μικρότερα είναι τα ποσοστά που αφορούν τον καρκίνο των ωοθηκών. Το φάσμα των μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 είναι αρκετά πολύπλοκο και ο εντοπισμός τους έχει πολύ μεγάλη διαγνωστική αξία. Εκτός των σημειακών μεταλλάξεων και των μικρών απαλοιφών και ενθέσεων μεγάλη προσοχή έχει δοθεί τα τελευταία χρόνια και στην ανίχνευση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων. Οι κληρονομικές γονιδιακές αναδιατάξεις έχουν βρεθεί να σχετίζονται με μία σειρά ανθρώπινων γενετικών ανωμαλιών στις οποίες εμπεριέχονται και διάφορα καρκινικά σύνδρομα. Από το 1997, όπου περιγράφηκε η πρώτη μεγάλη γονιδιακή αναδιάταξη στο γονίδιο BRCA1, έχει δειχθεί ότι η συνεισφορά των γονιδιακών αναδιατάξεων στο φάσμα όλων των μεταλλάξεων είναι πολύ σημαντική. Το ποσοστό των μεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA1 που οφείλεται σε γονιδιακές αναδιατάξεις κυμαίνεται μεταξύ 4% έως 20% στους διάφορους πληθυσμούς, εκτός των περιπτώσεων όπου εμφανίζονται ιδρυτικά φαινόμενα. Όσον αφορά το γονίδιο BRCA2, λόγω αρκετά μικρότερης έκτασης μελέτης το ποσοστό αυτό φαίνεται χαμηλότερο και κυμαίνεται μεταξύ 2% και 11%. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανίχνευση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 καθώς και η εκτίμηση της συνεισφοράς τους στο σύνολο των μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά σε Έλληνες ασθενείς με ιστορικό καρκίνο μαστού/ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικές τεχνικές, η πολλαπλή και ποσοτική PCR μικρών φθοριζόντων τμημάτων (QMPSF) και η πολλαπλή ενίσχυση τμημάτων μέσω ιχνηθετών (MLPA). Σε 112 οικογένειες με ιστορικό καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών που μελετήθηκαν με την τεχνική QMPSF, ανιχνεύθηκαν δύο διαφορετικές γονιδιακές αναδιατάξεις στο γονίδιο BRCA1 σε δύο διαφορετικές οικογένειες. Η πρώτη αφορά μία απαλοιφή περίπου 4 kb που εμπεριέχει το εξώνιο 20 και η δεύτερη μία απαλοιφή περίπου 4,5 kb που εμπεριέχει το εξώνιο 24 και την 3΄- μη κωδικοποιούσα περιοχή. Οι απαλοιφές αυτές επιβεβαιώθηκαν με PCR για την ενίσχυση μεγάλων τμημάτων DNA (Long - Range PCR).