Ανοσοϊστοχημική και μοριακή μελέτη των δεικτών pten, topoisomerase iiα και her3 στο καρκίνωμα του λάρυγγα, με τη μέθοδο των ιστικών μικροσυστοιχιών

Abstract

Cancer of the larynx (CL) is the most common neoplasm of the head and neck and is characterized by local aggressiveness. The majority of CL is squamous cell carcinomas and is the most common malignant tumor of larynx, pharynx and trachea. The majority of CLs is located in the glottic and superglottic region.The major causative factors are smoking and alcohol abuse. Significant predictors of CL are the poor differentiation of the tumor, lymph node metastasis, clear surgical margins, the AJCC and TNM staging. The aim of this thesis was to study the molecules HER3, PTEN and TopoIIa at the protein level by immunohistochemistry (IHC) method and at DNA level with fluorescent in situ hybridization (FISH) and to explore the possible prognostic significance. This study analyzed tumors from 122 patients with invasive CL. TMAs were created, in which were applied the specific methods. The study included 120 men and 2 women, with a mean age of 65.5 years. Active smokers were 81.2% of patients, while history of alcohol abuse was reported in 77.9%. The majority of tumors (98.4%) related to squamous cell carcinoma. The 57.4% of the tumors were located in the vocal chords and the surgical margins were invaded in 10/122 (8.2%) cases. Positive lymph nodes were found in 13 patients (10.7%). Locally advanced disease (stage T3-4) was found in 69.7% of patients, while 70.5% had advanced stage disease (III-IVA). The majority of patients were treated with total laryngectomy (87.7%). Preoperative external beam radiotherapy received 23.8% of patients, while postoperative external beam radiotherapy 22.1% of patients. Two patients received concomitant radiotherapy and chemotherapy. Relapses of the disease were observed in a total of 50/122 (41%) patients, with the majority concerning local recurrences (86%). The mean and 3-year disease-free survival (DFS) was 81 months (95% CI 38.3-123.7) and 58.5% respectively, while the 5-year DFS was 51.4%. The median and 3-year overall survival (OS) was 124.8 months (95% CI 4.9-180.1) and 67% respectively, while the 5-year OS was 59.8%. Expression of HER3 protein was observed in 52.5% of tumors, PTEN in 29.2% and 66.1% in TopoIIa tumors respectively. Amplification of HER3 gene was found in 4.2% of the cases, whereas 1.7%, of the cases showed TOP2A gene amplification. Finally, loss of PTEN gene was observed in 16.4% of the studied cases . The frequent expression of HER3 receptor in our cohort was independent of gene status, a finding that indicates that the observed gene amplification is likely to be due to frequent observed aneuploidy in CL. Loss of PTEN protein was common in advanced AJCC/TNM CL and independent of the corresponding gene loss. The CL often showed gains of CEP17 and CEP12, obviously as a phenomenon of increased genetic instability that characterizes these tumors. Kaplan-Meier analysis highlighted the following adverse prognostic indicators of DFS: alcohol abuse, histological differentiation, stage (T) of the tumor, lymph node metastasis and the combination of radiotherapy and chemotherapy, while favorable indicators were total laryngectomy and surgery. Patients whom tumors expressed TopoIIa, showed lower DFS compared to negative patients. The OS was also reduced in the group of patients with positive TopoIIa, but with a borderline significance. In the multivariate analysis independent predictors of DFS and OS were the lymphatic spread of the tumor (N+), alcohol abuse, TopoIIa expression and non-glottic tumor localization. Τhe infiltration of surgical margins showed negative predictive value only with the OS.

Ο καρκίνος του λάρυγγα (ΚΛ) αποτελεί το συχνότερο νεόπλασμα της κεφαλής και τραχήλου και χαρακτηρίζεται από τοπική επιθετικότητα. Η πλειονότητα των ΚΛ αφορούν καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα και είναι ο συχνότερος κακοήθης όγκος του λάρυγγα, του φάρυγγα και της τραχείας. Οι σημαντικότεροι αιτιολογικοί παράγοντες είναι το κάπνισμα και η κατάχρηση αλκοόλης. Σημαντικοί προγνωστικοί παράγοντες του ΚΛ αποτελούν η χαμηλή διαφοροποίηση του όγκου, η λεμφαδενική μετάσταση, τα υγιή χειρουργικά όρια, η ΤΝΜ και AJCC σταδιοποίηση. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν τα μόρια HER3, PTEN και TopoIIa σε επίπεδο πρωτεΐνης, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και σε επίπεδο DNA με τον φθορίζοντα επιτόπιο (in situ) υβριδισμό (FISH) και να διερευνηθεί η πιθανή προγνωστική σημασία τους. Η μελέτη ανέλυσε όγκους 122 ασθενών με διηθητικό καρκίνωμα λάρυγγα. Δημιουργήθηκαν μικροσυστοιχίες ιστικών κυλίνδρων όπου εφαρμόσθηκαν οι ειδικές μέθοδοι. Η μελέτη συμπεριέλαβε 122 ασθενείς εκ των οποίων 2 ήταν γυναίκες, με μέση ηλικία τα 65.5 έτη. Ενεργοί καπνιστές ήταν το 81.2% των ασθενών, ενώ ιστορικό κατάχρησης αλκοόλης αναφέρθηκε από το 77.9%. Η πλειονότητα των όγκων (98.4%) αφορούσε καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα. Το 57.4% των καρκινωμάτων εντοπίζονταν στις φωνητικές χορδές και τα χειρουργικά όρια ήταν διηθημένα σε 10/122 (8.2%) περιπτώσεις. Κλινικά και ακτινολογικά θετικοί επιχώριοι λεμφαδένες ανευρέθησαν σε 13 ασθενείς (10.7%). Το 69.7% των ασθενών είχαν τοπικά προχωρημένη νόσο, σταδίου T3-4 ενώ το 70.5% εμφάνιζε προχωρημένο στάδιο (III-IVΑ). Η πλειοψηφία των ασθενών είχε αντιμετωπισθεί με ολική λαρυγγεκτομή (87.7%). Προεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία έλαβε το 23.8% των ασθενών, ενώ μετεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία το 22.1% των ασθενών. Σε 2 ασθενείς χορηγήθηκε ταυτόχρονη ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Δεκαέξι ασθενείς (13.1%) εμφάνισαν χειρουργικές επιπλοκές. Υποτροπές της νόσου παρατηρήθηκαν συνολικά σε 50/122 (41%) ασθενείς, με την πλειοψηφία να αφορά τοπικές υποτροπές (86%). Η μέση και η 3-ετής ελεύθερη νόσου επιβίωση (ΕΥΕ) ήταν 81 μήνες (95% CI 38.3-123.7) και 58.5% αντίστοιχα, ενώ η 5-ετής ΕΥΕ 51.4%. Η μέση και 3-ετής συνολική επιβίωση (ΣΕ) ήταν 124.8 μήνες (95% CI 4.9-180.1) και 67% αντίστοιχα, ενώ η 5-ετής ΣΕ 59.8%. Έκφραση της HER3 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στο 52.5%, του PTEN στο 29.2% και της TopoIIα στο 66.1% των όγκων που μελετήθηκαν αντίστοιχα. Ενίσχυση του γονιδίου HER3 ανευρέθη στο 4.2%, του TOP2A γονιδίου στο 1.7% και απώλεια του γονιδίου PTEN στο 16.4% των μελετημένων περιπτώσεων. H συχνή έκφραση του HER3 υποδοχέα στους όγκους της μελέτη μας, ήταν ανεξάρτητη της γονιδιακής κατάστασης του HER3, εύρημα που πιθανότερο να οφείλεται στην συχνή ανευπλοειδία των ΚΛ. Η απώλεια της PTEN πρωτεΐνης είναι συχνή σε προχωρημένου ΤΝΜ και AJCC σταδίου ΚΛ και ανεξάρτητη από την απώλεια του αντίστοιχου γονιδίου. Οι ΚΛ εμφανίζουν συχνά επαύξηση των CEP17 και CEP12, προφανώς στα πλαίσια της αυξημένης γονιδιακής αστάθειας που τους χαρακτηρίζει. Δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες της ΕΥΕ στην ανάλυση Kaplan-Meier αναδείχθηκαν οι: κατάχρηση αλκοόλης, ιστολογική διαφοροποίηση, στάδιο (T) του όγκου, λεμφαδενική διήθηση και ο συνδυασμός ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας, ενώ ευνοϊκοί δείκτες η ολική λαρυγγεκτομή και η χειρουργική επέμβαση. Οι όγκοι που εξέφραζαν την TopoIIa εμφάνισαν μικρότερη ΕΥΕ σε σχέση με τους αρνητικούς ασθενείς, ενώ η ΣΕ ήταν επίσης μειωμένη στην ομάδα ασθενών με θετική την TopoIIa, χωρίς όμως να εμφανίζει ισχυρή συσχέτιση. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση προέκυψαν ότι η κατάχρηση αλκοόλης, η ύπαρξη διηθημένων λεμφαδένων (Ν+) και η έκφραση της TopoIIa αποτελούσαν αρνητικούς ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες για την ΕΥΕ και τη ΣΕ. Η μη γλωττιδική εντόπιση, σχετίσθηκε με μειωμένο κίνδυνο για την ΕΥΕ και ΣΕ, ενώ η διήθηση των χειρουργικών ορίων ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μόνο για την ΣΕ.