Συνθετικοί πεπτιδικοί φορείς για ανάπτυξη διαγνωστικών και προστατευτικής ανοσίας έναντι των ιών H5N1 και HIV

Abstract

The Highly Pathogenic Avian Influenza virus H5N1 (HPAIV H5N1) and human immunodeficiency virus (HIV) continue to pose a major threat to the public health due to the absence of effective therapeutic means. The development of an effective vaccine against these viruses is a high priority on research. The aim of the present study is the design, synthesis and the immunogenic evaluation of candidate peptide epitopes of the HPAIV H5N1 and HIV viruses in order to develop protective immunity and diagnostics. To enhance the immunogenicity of peptide epitopes, they must be conjugated to carrier-molecules. Therefore, the Sequential Oligopeptide Carrier (SOC4) was used to anchore the peptide epitopes. The SOC4 carrier is formed by the repetitive motif (-Lys-Aib-Gly-) and it was found that adopt the helical conformation. More specific, T-cell epitopes of the Hemagglutinin (HA) HPAIV H5N1 that were predicted by computational methods, were coupled on the Ac-SOC4-[2Αc, (ΝΗ2ΟCΗ2C(Ο))2]-ΝΗ2 carrier by oxime bond formation in three steps. In the first step the synthesis of the peptide epitopes and the SOC carrier was performed by SPPS. At the second step the creation of aldehyde groups on the epitopes was performed by oxidation and at the third step the ligation of the aldehyde epitope on the carrier was performed by oxime bond formation. These SOC-conjugates were used on mice immunizations. The SOC-conjugates induced small protective immunity, with the SOC-T4 conjugate showing maximum percentage (33%), giving thus a low immunogenicity on the corresponding epitope. Also, candidate HIV-1 epitopes for antibodies present in long-term non-progressors (LTNP) that were identified by the phage display technique, were coupled on the SOC4 carrier in four copies either by the step-by-step peptide solid phase synthesis or by chemoselective oxime bond formation. Cross-reactivity experiments, showed that the Ac-SOC4-(ASAKWSIGPGRA)4-OH (10) conjugate reacted strongly with patient sera LTNP, confirming the possible existence of preserved epitope as candidate for vaccine. Mice immunizations were also performed with conjugate (10) and the results confirmed the role of the SOC4 carrier to effectively enhance the epitope immunogenicity and the specificity of the epitope binding with the minimum carrier interaction. It is concluded that conjugate (10) can be used for the development of protective immunity and vaccines.

Ο υψηλής παθογένειας ιός της γρίπης των πτηνών (HPAIV) H5N1 και ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) εξακολουθούν να αποτελούν σοβαρή απειλή για την δημόσια υγεία λόγω έλλειψης αποτελεσματικών θεραπευτικών μέσων. Η ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού εμβολίου έναντι αυτών των ιών αποτελεί άμεση προτεραιότητα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο σχεδιασμός, η σύνθεση και ανοσογονική μελέτη υποψήφιων επιτόπων των ιών HPAIV H5N1 και HIV με σκοπό την ανάπτυξη προστατευτικής ανοσίας και διαγνωστικών. Για να ενισχυθεί η ανοσογονικότητα των επιτόπων θα πρέπει να συνδεθούν σε μόρια-φορείς. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε ο Επαναλαμβανόμενος Ολιγοπεπτιδικός Φορέας (Sequential Oligopeptide Carrier: SOCn) SOC4, για την πρόσδεση των επιτόπων. Ο φορέας SOC4, αποτελείται από το μοτίβο (-Lys-Aib-Gly-) και έχει βρεθεί από μελέτες ότι υιοθετεί ελικοειδή μορφή. Ειδικότερα, Τ-κυτταρικοί επίτοποι της αιμοσυγκολλητίνης (HA) του HPAIV H5N1 που προσδιορίστηκαν με υπολογιστικές μεθόδους προσδέθηκαν στον φορέα Ac-SOC4-[2Αc, (ΝΗ2ΟCΗ2C(Ο))2]-ΝΗ2 μέσω δεσμού οξίμης με μια διαδικασία τριών σταδίων. Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιήθηκε η σύνθεση των επιτόπων και του φορέα με SPPS. Στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιήθηκε η δημιουργία αλδεϋδομάδας στους επιτόπους μέσω οξείδωσης και στο τρίτο στάδιο έγινε η σύνδεση των αλδεϋδικών επιτόπων με το φορέα μέσω δεσμού οξίμης. Τα SOC-συμπλέγματα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα ανοσοποιήσεων σε ποντίκια και εμφάνισαν μικρή προστατευτική ανοσία, με το SOC-Τ4 σύμπλεγμα να εμφανίζει το μεγαλύτερο ποσοστό (33%), προσδίδοντας έτσι μια μικρή ανοσογονικότητα στον αντίστοιχο επίτοπο. Επίσης, υποψήφιοι HIV επίτοποι για αντισώματα ασθενών που δεν έχουν ασθενήσει εδώ και πολλά χρόνια (Long-term non progressors, LTNP) που προσδιορίστηκαν με την τεχνική έκθεσης σε φάγους προσδέθηκαν στον φορέα σε τέσσερα αντίγραφα είτε με τη βήμα-προς-βήμα πεπτιδική σύνθεση είτε με μέσω δεσμού οξίμης. Από πειράματα διασταυρωτής αντίδρασης, το σύμπλεγμα Ac-SOC4-(ASAKWSIGPGRA)4-OH (10) αντέδρασε ισχυρά με ορούς ασθενών LTNP, επιβεβαιώνοντας την πιθανή ύπαρξη διατηρημένου επιτόπου ως υποψήφιου για εμβόλιο. Επίσης, από ανοσοποιήσεις ποντικιών με το ανάλογο (10) πιστοποιήθηκε ο ρόλος του φορέα SOC4 για την αποτελεσματική αύξηση της ανοσογονικότητας του επιτόπου καθώς και η εξειδίκευση πρόσδεσης του επιτόπου μέσω της ελάχιστης αναγνώρισης του φορέα. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι το σύμπλεγμα (10) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη προστατευτικής ανοσίας και εμβολίων.