Μηχανισμοί αντοχής πολυανθεκτικών νοσοκομειακών στελεχών Pseudomonas aeruginosa

Abstract

The aim of this study is the analysis of the underlying mechanisms of resistance in 23 multiple-antibiotic resistant (Mar) Pseudomonas aeruginosa isolates that were isolated during 1992-1995 in six different tertiary hospitals, lying in the metropolitan area of Athens. According to the current epidemiological standards (Pulsed Field Gel Electrophoresis) the vast mejority was not releated to each other, whereas their serological classification revealed that the main serotypes present were 012, 011 and 05.As far as the mechanisms of resistance to quinolones are concerned, the presence of point mutations (Thr83—file, Asp87—>Tyr) in the QRDR of the gyrA gene was identified in all strains, while a far smaller percentage (17%) among them harboured mutations in the same region of gyrB. It is worth mentioning that a novel, double mutation (Thr83—»Ile&Asp82—»Tyr) with unknown significance that has never before been reported in the literature, was identified in a single strain with MIC to ciprofloxacin equal to 64pg/ml. It is also interesting that neither the number nor the kind of the mutations in the subunits of either DNA gyrase or topoisomerase IV (parC) preclyde the levels of resistance to ciprofloxacin, as opposed to what is known about clinical quinolone-resistant P. aeruginosa isolates, but in accordance to the literature concerning other gram negative rods.Aside from the mutations in their cellular target, resistance to quinolones also involved the participation of non-specific mechanisms of resistance (efflux pumps), that can smoothly explain the simultaneous resistance of the strains studied to a variety of antimicrobial agents. The majority of them is characterized by the synchronous presence of double combinations of active efflux pumps (MexABoprM&MexCDOprJ), whereas in the rest of the strains the presence of three, one or the lack of active efflux pumps was correspondigly presumed in three, five and one strain. On the other hand, the explanation for the statistically significant negative correlation between the number of active efflux pumps in each strain and its MIC levels to ciprofloxacin, might either be related to the grounds of restriction of cellular expenditure as the activity of non-specific mechanisms of resistance towards isolated antimicrobials demands a great amount of energy, or it might also be due to the presence of a confounding factor which is the DNA gyrase mutations, since they are independently related with both the MIC levels to ciprofloxacin and the number of the active efflux pumps in each strain.The resistance to aminoglycosides was genotypically identified to be due to the presence of various combinations of up to eight different enzymes in each strain. Among them specific attention should be drawn to the gene encoding the bifunctional enzyme [aac(6)IIl+aph(2")] of the gram positives which not only lies but also is being expressed (translated) from the P. aeruginosa genome. Its astonishing transfer to the gram negatives from the gram positives has once more been reported in P. aeruginosa isolates from the Chech Republic and it can very well explain the Aminoglycoside Resistance Profiles identified, keeping in agreement with the dogma of expression of the smallest possible number of genes that can confer a particular resistance phenotype.The expression of beta-lactam resistance is the net result of interaction between specific enzymatic (beta-lactamases) mechanisms that tend to desactivate the drug and non-enzymatic mechanisms of resistance (efflux pumps, absence of OprD2) that aim to reduce the amount of drug necessary to interact with its target (penicillinbinding proteins). Among them, the efflux pumps were once more announced as omnipresent, as in particular the MexABOprM pump that extrudes the vast majority of beta-lactam molecules, was identified either alone or in combination in allmost every single strain. From the epidemiological point of view it is important to mention the presence of the VIM family of metalloenzymes (VIM-2 & VIM-4) -the sole carbapenemases identified in the study- in Athens since 1992 (year of the isolation of the strains). Furthermore, the unexpected presence of the OprD2 porin in at least 50% of the 23 imipenem-resistant strains without the concomitant MexEFoprN efflux pump expression, with which it has the same transcriptional and post-transcriptional regulations, is also noteworthy and if it is not due to the presence of other -yet unidentified- mechanisms of carbapenem resistance (i.e new carbapenemases) needs further molecular investigation.

Η μελέτη αφορά την ανάλυση των υποκειμένων μηχανισμών αντοχής 23 πολυανθεκτικών (Mar) στελεχών Pseudomonas aeruginosa που απομονώθηκαν τη χρονική περίοδο 1992-1995 σε έξι νοσηλευτικά ιδρύματα της περιοχής των Αθηνών, ήταν -ως επί το πλείστον- επιδημιολογικά μη σχετιζόμενα και κατανέμονταν (κατά κύριο λόγο) στους οροτύπους 012, 011 και 05.Σε ό,τι αφορά στις κινολόνες, οι μηχανισμοί αντοχής που διαπιστώθηκαν αφορούν κατ’ αρχήν σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή QRDR του γονιδίου gyrA (Thr83—>Ile, Asp87—>Tyr) στο σύνολο των στελεχών, ενώ σε μικρότερο ποσοστό (17%) ανιχνεύθηκαν μέσω της SSCP μεταλλάξεις στην ίδια περιοχή του gyrB. Υπογραμμίζεται παρουσία στελέχους με ενδιάμεσα επίπεδα αντοχής για τη σιπροφλοξασίνη (64μg/ml) που εμφανίζει διπλή μετάλλαξη (Thr83—»Ue&Asp82—»-Tyr) άγνωστης σημασίας, χωρίς προηγούμενο βιβλιογραφικό δεδομένο. Επιπρόσθετα, φαίνεται πως ο αριθμός ή και το είδος των μεταλλάξεων στα μόρια των τοποϊσομερασών II (gyrA, gyrB) και IV (parC) δεν προδικάζουν και τα επίπεδα αντοχής στη σιπροφλοξασίνη (ΕΑΠς) των στελεχών της μελέτης, σε αντίθεση με κλινικά στελέχη με μεμονωμένη αντοχή στις κινολόνες, αλλά σε συμφωνία με παρατηρήσεις για άλλα αρνητικά κατά gram βακτηρίδια.Εκτός από τις μεταλλάξεις του στόχου δράσης, ανιχνεύθηκε και η παρουσία μηχανισμών ενεργού εκροής τύπου αντλίας, οι οποίοι ως μη ειδικοί μηχανισμοί αντοχής εκτός από τη συμβολή τους στην αντοχή στις κινολόνες, μπορούν, επίσης, να ερμηνεύσουν και το φαινότυπο πολυαντοχής των στελεχών που μελετήθηκαν. Η πλειοψηφία των στελεχών φέρει συνδυασμό δύο αντλιών ενεργού αποβολής (MexABoprM/MexCDOprJ), ενώ σε τρία στελέχη ανιχνεύθηκαν τρεις αντλίες, σε πέντε στελέχη μία αντλία και σε ένα στέλεχος δεν παρατηρήθηκε έκφραση καμμίας εκ των αντλιών. Η στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των ενεργών -ανά στέλεχος- αντλιών και των επιπέδων των ΕΑΠς για τη σιπροφλοξασίνη, θα μπορούσε πιθανόν να ερμηνευθεί είτε με βάση την οικονομία του βακτηριακού κυττάρου ως προς την κινητοποίηση των μη ειδικών μηχανισμών αντοχής στην έκφραση αντοχής σε μεμονωμένα αντιμικροβιακά, είτε με βάση την παρουσία συγχυτικού παράγοντα: τις μεταλλάξεις στις υπομονάδες της DNA γυράσης.Ως προς την αντοχή στις αμινογλυκοσίδες, η οποία είναι διασταυρούμενη και υψηλού επιπέδου, ο γονότυπος αποκαλύπτει τη σύγχρονη παρουσία έως και οκτώ διαφορετικών ενζύμων ανά στέλεχος, ανάμεσα στα οποία ιδιαίτερη εντύπωση προκαλεί το γονίδιο που κωδικοποιεί το διπλής λειτουργικότητας ένζυμο των θετικών κατά gram [aac(6)III+aph(2 ")], το οποίο και εκφράζεται (μεταγράφεται) όπως άμεσα αποδεικνύεται από τα αποτελέσματα της ραδιοϊσοτοπικής μεθόδου. Η παρουσία του ενζύμου αυτού στην Ρ.aeruginosa που έχει επίσης αναφερθεί σε στελέχη που έχουν απομονωθεί στην Τσεχία, ερμηνεύει ικανοποιητικά τα παρατηρηθέντα πρότυπα αντοχής στις αμινογλυκοσίδες (AGRPs) των στελεχών της μελέτης, ενώ συμβάλλει τα μέγιστα στην κυτταρική οικονομία (μικρότερος αριθμός ενεργών γονιδίων προκειμένου να ερξασφαλισθεί ο ίδιος φαινότυπος αντοχής). Σε ό,τι αφορά τα υπόλοιπα ένζυμα, επιβεβαιώνεται η σχεδόν συνώνυμη του είδους Ρ. aeruginosa παρουσία της AAC(6')-II.Η έκφραση αντοχής στις β-λακτάμες αποτελεί τη συνισταμένη της αλληλεπίδρασης ενζυμικών και μη μηχανισμών αντοχής οι οποίοι στοχεύουν είτε στην ελάττωση της διαθέσιμης προς αλληλεπίδραση με τις πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες ποσότητας αντιμικροβιακού (συστήματα ενεργού αποβολής τύπου αντλίας και απουσία της OprD2), είτε στην αδρανοποίηση αυτού μέσω παραγωγής εξειδικευμένων ενζύμων (β-λακταμάσες). Από αυτούς, στα στελέχη της μελέτης αποδεικνύεται η παρουσία τόσο των συστημάτων ενεργού αποβολής κι ιδιαιτέρως του MexABOprM (είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με τις άλλες αντλίες ενεργού αποβολής) που εκβάλλει τα περισσότερα από τα β-λακταμικά μόρια, όσο και των β- λακταμασών όλων των μοριακών τάξεων. Ιδιαίτερη μνεία χρήζει η επιδημιολογικά σημαντική διαπίστωση ότι τα μεταλλοένζυμα της οικογένειας των VIM (VIM-2 & VIM-4) που απετέλεσαν τις μοναδικές καρβαπενεμάσες που ανιχνεύθηκαν στα μελετηθέντα στελέχη Ρ. aeruginosa υπήρχαν στην περιοχή των Αθηνών ήδη από την περίοδο 1992-1995. Από τους μηχανισμούς αντοχής στις καρβαπενέμες, δευτερεύοντα ρόλο φαίνεται ότι διαδραματίζει η συσχέτιση της παρουσίας της OprD2 με την αντοχή στην ιμιπενέμη για τα στελέχη της παρούσας μελέτης, εφόσον διαπιστώθηκε ελαττωμένη ή και απούσα μόλις στο 50% των στελεχών που στο σύνολό τους χαρακτηρίζονταν από το φαινότυπο (ΙΜΡ)Κ, χωρίς να υπερεκφράζουν ταυτόχρονα το MexEFOprN όπως θα αναμενόταν με βάση την κοινή μεταγραφική και μετά-μεταγραφική τους ρύθμιση.