Επιδημιολογική μελέτη των πλασμιδιακών μηχανισμών αντοχής στις κινολόνες σε εντεροβακτηριακά που απομονώνονται από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ΑΤΤΙΚΟΝ

Abstract

ABSTRACTQuinolone resistance in Gram-negative bacteria is mostly mediated by point mutations in the quinolone resistance-determining regions (QRDRs) of the gyrase and topoisomerase IV genes, leading to target modification. Additionally, three plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) mechanisms have been described since 1998: (i) Qnr peptides, capable of protecting DNA gyrase and Topoisomerase IV from quinolones, (ii) Aac(6’)-Ib-cr aminoglycoside acetyltranferase, modifying quinolones with a piperazinyl substituent (norfloxacin and ciprofloxacin) and (iii) the quinolone efflux pumps (QepA and OqxA & B).PMQR has been found in clinical and environmental isolates around the world and appears to be spreading.. The plasmid-mediated mechanisms provide only low-level resistance that by itself does not exceed the clinical breakpoint established by EUCAST for susceptibility. Nonetheless, the presence of PMQR determinants in isolates with additional chromosome-borne mechanism(s) facilitates higher-level of quinolone resistance, and their co-exhistance with other resistance determinants especially genes coding for β-lactamases including ESBLs and carbapenemases, located in the same conjugative plasmids, indicates selection and spreading of multidrug-resistance due to excessive use of quinolones.The aim of this study was to investigate the prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes in an unselected collection of Gram-negative strains isolated from hospitalized patients over an 18-month period in a laboratory affiliated to a University General Hospital in Athens. Additionally, to investigate their coexistence progeny resistant to other antimicrobial groups such as beta-lactamases and carvapenemases, in the same conjugative plasmids. Finally, to assess the impact of the PMQR, on the in vitro activity of ciprofloxacin and levofloxacin.We studied 96 strains of Gram-negative strains isolated from bacteremia, and 340 E. coli strains (n = 185) and K.pneumoniae (n = 155) isolated from urinary tract infections, pus or bronchial secretions in the Infectious Diseases Reaserch Laboratory of the 4th Department of Internal Medicine of University General Hospital 'Attikon', the period October 2008 to March 2010. All isolates were resistant to nalidixic acid and susceptible or resistant to fluoroquinolones. Only one isolate per patient was included in the study.We found that the prevalence of PMQR genes was 17.2% among all strains tested and 7.3% among unselected bloodstream Gram-negative isolates in our institution, indicating that plasmid-mediated quinolone resistance in Greece, may be more frequent than previously suggested. Also, for the first time, to our knowledge, the co-existence of qnrS1 and aac(6’)-Ib-cr in the same plasmid was detected.The results of our cloning experiments are in agreement with the current knowledge that a single PMQR determinant by itself provides only a low level of resistance to quinolones comparable to that provided by a first-step mutation in DNA gyrase. Also, we have seen that qnrS1 is responsible for a lower level of resistance as compared to qnrA1 or qnrB2 when expressed in laboratory strains. Additionally, PMQR genes and/or mutations in QRDR may increase the MIC above the susceptibility breakpoint . Nonetheless, the most important consequence of the dissemination of PMQR-carrying plasmids is their role in facilitating the selection of higher-level quinolone-resistant mutants and the co-selection of other resistance determinants residing on the same plasmid, especially genes coding for β-lactamases including ESBLs and carbapenemases . MPC evaluation in clinical and laboratory isolates confirmed the contribution of PMQR determinants in widening the MSW of both ciprofloxacin and levofloxacin, for most of the isolates tested, to levels above peak serum concentrations attained during drug therapy, rendering the attainment of AUC/MPC criterion impossible to meet by conventional dosing . Under these circumstances, quinolone monotherapy will select for high-level quinolone resistance.Time-kill assays undertaken using the quinolone-susceptible clinical and laboratory isolates confirmed that the presence of PMQR determinants may occasionally compromise the bactericidal activity of ciprofloxacin and levofloxacin, especially when expressed in E.cloacae, S.maltophilia or K.pneumoniae and when more than one PMQR determinants coexist.Finally, inoculum effect evaluation in the present study revealed that the MICs of all clinical isolates increased above the susceptibility breakpoint for both quinolones tested in the presence of high inoculum suggesting that, in the context of a clinical infection, PMQR-harboring pathogens may fail quinolone treatment. In summary, we have found that the prevalence of PMQR genes in Gram-negative isolates is higher than previously suggested in Greece. The PMQR can compromise the in vitro efficacy of quinolones if expressed in a favorable genetic background, they can enlarge the MSW of these agents facilitating the selection of higher-resistant mutants and they may contribute to clinical failure in the setting of high-inoculum infections. Empirical treatment with quinolones must be used with caution and must be avoided in infections due to nalidixic acid resistant isolates or when exhibit an MIC≥0.25mg/L to either ciprofloxacin or levofloxacin.PMQR determinants represent an actual threat that may go unnoticed. There are no phenotypic markers that indicate their presence, therefore, it is necessary to monitor for their spread. Analysis of plasmids and genetic structures on which PMQR determinants are mounted is needed in order to better understand their successful dissemination.

ΠΕΡΙΛΗΨΗΑπό το 1998, πέραν των ήδη γνωστών χρωμοσωμιακών μηχανισμών, έχουν ανακαλυφθεί τρεις μηχανισμοί για την πλασμιδιακά κωδικοποιούμενη αντοχή στις κινολόνες (PMQR). Ο πρώτος αφορά τα πλασμιδιακά γονίδια qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, και qnrVC που κωδικοποιούν πρωτεΐνες της οικογένειας επαναλλαμβανόμενων πενταπεπτιδίων που προστατεύουν την DNA γυράση και την τοποϊσομεράση IV από την δράση των κινολονών. Ο δεύτερος μηχανισμός πλασμιδιακής αντοχής, περιλαμβάνει ακετυλίωση των κινολονών από μια παραλλαγή της κοινής ακετυλοτρανσφεράσης AAC (6 ') – Ιb που τροποποιεί τις αμινογλυκοσίδες. Ο τρίτος μηχανισμός είναι μια αντλία ενεργητικής εκροής που παράγεται από τα πλασμιδιακά γονίδια QepAB και OqxAB. Η PMQR έχει βρεθεί σε κλινικά αλλά και περιβαλλοντικά στελέχη σε όλο τον κόσμο και φαίνεται να εξαπλώνεται με τη πάροδο του χρόνου. Η ύπαρξη των γονιδίων αυτών (PMQR), δεν φαίνεται να προσφέρει ανιχνεύσιμη αντοχή στις κινολόνες σύμφωνα με τα κριτήρια της EUCAST (>2mgL για την σιπροφλοξασίνη). Όταν όμως, συνδυαστούν με χρωμοσωμικές μεταλλαγές αυξάνουν σε αξιοσημείωτα επίπεδα την αντοχή στις κινολόνες, ενώ η συνύπαρξη τους με γονίδια αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών, όπως οι β-λακταμάσες και οι καρβαπενεμάσες, στα ίδια συζευκτικά πλασμίδια, υποδηλώνει τη δυνατότητα επιλογής και διασποράς πολυαντοχής με την άσκοπη χρήση των κινολονών.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της συχνότητας εμφάνισης πλασμιδιακά κωδικοποιούμενης αντοχής στις κινολόνες μέσω της ομάδας γονιδίων qnr, του γονιδίου aac(6’)Ib-cr και των γονιδίων αντλίας qepA και oqxAB, σε Gram-αρνητικά στελέχη τα οποία απομονώνονται από καλλιέργειες ασθενών που νοσηλεύονται σε μεγάλο Πανεπιστημιακό νοσοκομείο της Αθήνας. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η συνύπαρξη τους με γόνους αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών όπως οι β-λακταμάσες και οι καρβαπενεμάσες, στα ίδια συζευκτικά πλασμίδια. Τέλος εκτιμήθηκε η κλινική επίδραση των πλασμιδιακά κωδικοποιούμενων γονιδίων αντοχής στις κινολόνες, μέσω της επίπτωσης στη βακτηριοκτόνο δράση και στο παράθυρο επιλογής μεταλλαγών (mutant selection window) MSW, της σιπροφλοξασίνης και της λεβοφλοξασίνης.Μελετήθηκαν 96 στελέχη Gram-αρνητικά στελέχη που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες, και 340 στελέχη E.coli (n=185) και K.pneumoniae (n=155) που απομονώθηκαν από ουρoλοιμώξεις, πύα ή βρογχικές εκκρίσεις στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων και Αντιμικροβιακής Θεραπείας της Δ΄ Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ‘Αττικόν’, το διάστημα Οκτώβριος 2008 έως Μάρτιος 2010. Τα στελέχη αυτά, παρουσιάζαν αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ και ευαισθησία ή αντοχή στις νεώτερες κινολόνες. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε αυστηρά ένα στέλεχος ανά ασθενή. Διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα ανίχνευσης των PMQR γονιδίων ήταν 17,2% μεταξύ όλων των ανθεκτικών στο ναλιδιξικό οξύ στελεχών που ελέγχθηκαν και 7,3% μεταξύ αυτών που είχαν απομονωθεί από καλλιέργειες αίματος. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η πλασμιδιακά κωδικοποιούμενη αντοχή στις κινολόνες μπορεί να είναι πιο συχνή από ότι έχει αναφερθεί μέχρι τώρα στη χώρα μας. Επίσης, με βάση αυτά που γνωρίζουμε, για πρώτη φορά ανιχνεύτηκαν στο ίδιο πλασμίδιο τα γονίδια qnrS1 και aac(6')- Ιb-cr.Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτής της μελέτης με μετασυζευγμένα/μετασχηματισμένα στελέχη στα οποία είχε μεταφερθεί πλασμίδιο με ένα ή περισσότερα γονίδια PMQR, συμφωνούν με την τρέχουσα βιβλιογραφία που δείχνει ότι ένα PMQR γονίδιο δρώντας μόνο, παρέχει μόνο χαμηλού επιπέδου αντοχή στις κινολόνες, συγκρίσιμη με εκείνη που παρέχει ή πρώτη μετάλλαξη στη DNA γυράση. Επίσης, είδαμε ότι το qnrS1 είναι υπεύθυνο για χαμηλότερου επιπέδου αντοχή σε σύγκριση με τα qnrA1 και qnrB2 όταν εκφράζεται σε εργαστηριακά στελέχη. Πρόσθετα γονίδια PMQR ή / και μεταλλάξεις στην QRDR μπορεί να αυξήσουν συνεργικά την MIC πάνω από τα καθορισμένα επίπεδα ευαισθησίας. Εντούτοις, η πιο σημαντική συνέπεια των γονιδίων PMQR, είναι ο ρόλος τους στην επιλογή στελεχών με υψηλότερου επιπέδου αντοχή στις κινολόνες, καθώς και την συν-επιλογή άλλων γονιδίων αντοχής που εδράζονται στο ίδιο πλασμίδιο, ειδικά γονίδια που κωδικοποιούν β-λακταμάσες, συμπεριλαμβανομένων των ESBLs και των καρβαπενεμασών. Στην παρούσα μελέτη, ο προσδιορισμός της MPC χρησιμοποιώντας κλινικά και εργαστηριακά στελέχη, επιβεβαίωσε τη συμβολή των γονιδίων PMQR στη διεύρυνση του MSW τόσο της σιπροφλοξασίνης όσο και της λεβοφλοξασίνης (για τα περισσότερα από τα στελέχη που εξετάστηκαν), σε επίπεδα πάνω από αυτά που επιτυγχάνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας με το αντίστοιχο φάρμακο,, καθιστώντας την επίτευξη του κριτηρίου AUC/MPC, αδύνατον να καλυφθεί με συμβατικές δόσεις. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μονοθεραπεία με κινολόνη θα έχει σαν απότοκο την επιλογή υψηλού επιπέδου αντοχής στις κινολόνες και πιθανόν την κλινική αποτυχία κατά τη διάρκεια της θεραπείας.Οι δοκιμασίες του χρόνου θανάτωσης που πραγματοποιήθηκαν με χρήση ευαίσθητων στις κινολόνες κλινικών και εργαστηριακών στελεχών επιβεβαίωσαν ότι η παρουσία των γονιδίων PMQR μπορεί ενίοτε να θέσει σε κίνδυνο τη βακτηριοκτόνο δράση της σιπροφλοξασίνης και της λεβοφλοξασίνης, ειδικά όταν εκφράζονται σε στέλεχη E.cloacae, S.maltophilia ή K.pneumoniae και, όταν συνυπάρχουν περισσότερα του ενός γονίδια PMQR.Τέλος, η αξιολόγηση της επίδρασης του ενοφθαλμίσματος στην ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα, στην παρούσα μελέτη, αποκάλυψε ότι η MIC όλων των κλινικών στελεχών αυξήθηκε πάνω από το όριο ευαισθησίας και για τις δύο κινολόνες που μελετήθηκαν, με την παρουσία ενός υψηλότερου ενοφθαλμίσματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι, στο πλαίσιο μιας κλινικής λοίμωξης με υψηλό μικροβιακό φορτίο, τα παθογόνα που φέρουν PMQR, μπορούν να οδηγήσουν σε αποτυχία την θεραπεία με κινολόνες. Συμπερασματικά, διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα ανίχνευσης γονιδίων PMQR σε πληθυσμό Gram-αρνητικών μικροβίων είναι υψηλότερη από οτι είχε μέχρι σήμερα αναφερθεί στη χώρα μας. Τα γονίδια PMQR μπορούν να θέσουν σε κίνδυνο την in vitro αποτελεσματικότητα των κινολονών, εάν εκφραστούν σε ένα ευνοϊκό γενετικό υπόβαθρο, μπορούν να διευρύνουν το MSW των κινολονών διευκολύνοντας την επιλογή ανθεκτικών στελεχών και τέλος, να συμβάλλουν στην κλινική αποτυχία σε λοιμώξεις με υψηλό μικροβιακό φορτίο. Η εμπειρική χρήση κινολονών πρέπει να γίνεται με σκεπτικισμό και να αποφεύγεται η χορήγηση τους για λοιμώξεις από στελέχη με αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ ή με MIC≥0.25mg/L στη λεβοφλοξασίνη ή τη σιπροφλοξασίνη. Τα γονίδια PMQR αποτελούν μια πραγματική απειλή που εντούτοις, μπορεί να διαλάθει της προσοχής. Η παρουσία τους συχνά είναι δύσκολο να προσδιοριστεί ελλείψει κατάλληλων φαινοτυπικών δεικτών και η στρατηγική μακροπρόθεσμης προοπτικής επιτήρησης των γονιδίων PMQR φαίνεται οτι είναι απαραίτητη. Περισσότερες μελέτες απαιτούνται στο μέλλον, με επίκεντρο την ανάλυση των πλασμιδίων και των γενετικών δομών πάνω στις οποίες εδράζονται τα PMQR για την καλύτερη κατανόηση της επιτυχούς διάδοσης τους.