Περίληψη
Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της μεταγωγής σημάτων από αυξητικούς παράγοντες σε κύτταρα θηλαστικών. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, στις οποίες εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι της πρωτεωμικής τεχνολογίας για την ανίχνευση νέων μορίων μεταγωγής σήματος. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές A431 (ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα), MRC5 (ανθρώπινοι ινοβλάστες) και PC12 (κύτταρα φαιοκυτοχρώματος αρουραίου) χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα συστήματα για τη μελέτη των αυξητικών παραγόντων EGF, PDGF και NGF αντίστοιχα. Με τον τρόπο αυτό ταυτοποιήθηκαν 14 πρωτεΐνες. Κάποιες από αυτές είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι σχετίζονται άμεσα με τη επίδραση αυξητικών παραγόντων (π.χ. δισουλφιδική ισομεράση, PCNA, γαλεκτίνη-3, αφυδρογονάση του γαλακτικού, κινάση της αδενοσίνης). Κάποιες άλλες (προχιμπιτίνη, ΑΗΑ1, NDRG1, PAK2, EBP1) μπορούν να συσχετιστούν έμμεσα με τους αυξητικούς παράγοντες, καθώς η λειτουργία τους είναι σε συμφωνία με τις ...
Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της μεταγωγής σημάτων από αυξητικούς παράγοντες σε κύτταρα θηλαστικών. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, στις οποίες εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι της πρωτεωμικής τεχνολογίας για την ανίχνευση νέων μορίων μεταγωγής σήματος. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές A431 (ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα), MRC5 (ανθρώπινοι ινοβλάστες) και PC12 (κύτταρα φαιοκυτοχρώματος αρουραίου) χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα συστήματα για τη μελέτη των αυξητικών παραγόντων EGF, PDGF και NGF αντίστοιχα. Με τον τρόπο αυτό ταυτοποιήθηκαν 14 πρωτεΐνες. Κάποιες από αυτές είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι σχετίζονται άμεσα με τη επίδραση αυξητικών παραγόντων (π.χ. δισουλφιδική ισομεράση, PCNA, γαλεκτίνη-3, αφυδρογονάση του γαλακτικού, κινάση της αδενοσίνης). Κάποιες άλλες (προχιμπιτίνη, ΑΗΑ1, NDRG1, PAK2, EBP1) μπορούν να συσχετιστούν έμμεσα με τους αυξητικούς παράγοντες, καθώς η λειτουργία τους είναι σε συμφωνία με τις συνέπειες των αυξητικών παραγόντων στα αντίστοιχα κυτταρικά συστήματα. Μία τρίτη κατηγορία πρωτεϊνών, (p47, τρυπτοφανυλ-tRNA συνθετάση) περιλαμβάνει μόρια τα οποία εμπλέκονται με διαδικασίες, οι οποίες επίσης επηρεάζονται από αυξητικούς παράγοντες, όπως η ωρίμανση των μορίων RNA και η πρωτεϊνοσύνθεση. Υπάρχει, τέλος, το παράδειγμα της κατεψίνης D, της οποίας η λειτουργία δεν μπορεί να συσχετιστεί με τους αυξητικούς παράγοντες απουσία άλλων πειραματικών δεδομένων. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις παραπάνω πρωτεΐνες έγινε με την ημιποσοτική μέθοδο RT-PCR. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι στην περίπτωση των μορίων mRNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη NDRG1 παρατηρείται στατιστικά σημαντική μεταβολή έπειτα από την επίδραση με τον αυξητικό παράγοντα EGF. Οι ποσοτικές μεταβολές που αφορούν τις υπόλοιπες πρωτεΐνες δεν φαίνεται να οφείλονται σε αντίστοιχες μεταβολές του επιπέδου των μορίων mRNA και πιθανόν να οφείλονται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ενδοκυτταρικές μετατοπίσεις ή γενικότερα σε διαδικασίες που εμπλέκονται στο μετα-μεταφραστικό έλεγχο. Μια από αυτές τις πρωτεΐνες, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη προχιμπιτίνη, μελετήθηκε περαιτέρω με βιοχημικά πειράματα εξαιτίας του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και στην προστασία των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών από την αποικοδόμηση. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι οι αυξητικοί παράγοντες PDGF και NGF επιφέρουν αντίθετα αποτελέσματα στα επίπεδα της πρωτεΐνης, ενώ τα επίπεδα των μορίων mRNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη παραμένουν αμετάβλητα. Πειράματα ανάλυσης κατά Western έδειξαν ότι ενώ το συνολικό ποσό της πρωτεΐνης δεν επηρεάζεται από την επίδραση αυξητικών παραγόντων, το διαλυτό κλάσμα της προχιμπιτίνης είναι αυτό που μειώνεται έπειτα από επίδραση με PDGF. Σύμφωνα με πειράματα ανοσοκυτταροχημείας που έγιναν στην παρούσα μελέτη, η προχιμπιτίνη εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια των ινοβλαστών MRC5 και ο εντοπισμός αυτός είναι ανεξάρτητος της επίδρασης με PDGF. Τα ίδια πειράματα έδειξαν ότι ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων προκαλεί συγκέντρωση των μιτοχονδρίων στην περιπυρηνική περιοχή των ινοβλαστών αυτών, φαινόμενο το οποίο συνοδεύεται από παράλληλη μείωση της διαλυτότητας της προχιμπιτίνης. Παράλληλα, η μελέτη της επίδρασης των αυξητικών παραγόντων εστιάστηκε στο βιοχημικό μονοπάτι της κινάσης Αkt. Συγκεκριμένα, τα πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα που σχηματίζονται με την κινάση Akt απομονώθηκαν με στόχο την ανίχνευση νέων μορίων που αλληλεπιδρούν άμεσα με τη συγκεκριμένη κινάση. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στην απομόνωση του συμπλόκου που σχηματίζει η κινάση Akt με την πρωτεΐνη Hsp90. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκε και η τουμπουλίνη ως πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την κινάση Akt. Τέλος, μελετήθηκαν πρωτεϊνικά δείγματα που απομονώθηκαν από πνεύμονες ποντικών, στα οποία είχε απενεργοποιηθεί το γονίδιο της ισομορφής Akt3. Στα δείγματα αυτά διαπιστώθηκε ότι η αντιοξειδωτική πρωτεΐνη AOP2 υφίσταται οξείδωση στην κυστεΐνη του ενεργού της κέντρου. Αυτή η οξειδωτική τροποποίηση, σε συνδυασμό με την αύξηση των οξειδωμένων πρωτεϊνών στα δείγματα Akt3 -/- οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η απουσία της κινάσης Akt3 προκαλεί πιθανότατα οξειδωτικό stress στα κύτταρα των πνευμόνων. Η οξείδωση της κυστεΐνης του ενεργού κέντρου της AOP2 σε σουλφινικό οξύ καθιστά το μόριο ανενεργό, καθώς δεν μπορεί να ανάγει πλέον άλλες οξειδωμένες ομάδες και το γεγονός αυτό μειώνει την αντιοξειδωτική προστασία του κυττάρου. Παρόλο που δεν παρατηρήθηκε αυξημένη ευαισθησία των αθανατοποιημένων ινοβλαστών από τα ποντίκια Akt3 -/- στην χορήγηση εξωγενούς H2O2 σε σχέση με τους αντίστοιχους φυσικού τύπου, το γεγονός αυτό δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα την κατάσταση των κυττάρων in vivo. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή συνέβαλε στη μελέτη της μεταγωγής σημάτων από αυξητικούς παράγοντες και οδήγησε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών, οι οποίες ρυθμίζονται από τους παράγοντες PDGF, EGF ή NGF. Παράλληλα, μελετήθηκε το βιοχημικό μονοπάτι της κινάσης Akt, τόσο μέσω της απομόνωσης των συμπλόκων που σχηματίζει η κινάση, όσο και μέσω σύγκρισης του πρωτεϊνικού προτύπου κυττάρων Akt3 -/- με το αντίστοιχο κυττάρων φυσικού τύπου.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The aim of this thesis is the study of growth factor-regulated signal transduction in mammalian cells. In the present study, the proteomic approach has been applied to three different cell lines in order to detect new signal transduction molecules. A431 human epithelial cells, MRC5 human fibroblasts, and PC12 cells, derived from a rat pheochromocytoma tumor, were used as models for studying epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and nerve growth factor (NGF), respectively. That strategy led to the identification of 14 proteins. Several of these proteins have been previously directly associated with growth factor stimulation (disulfide isomerase, PCNA, galectin-3, adenosine kinase). Some of the other proteins that have been identified (prohibitin, AHA1, NDRG1, PAK2, EBP1), whose function is known, may be indirectly correlated to growth factors, since their function is in accordance to the consequences of growth factor stimulation to the respective cellular ...
The aim of this thesis is the study of growth factor-regulated signal transduction in mammalian cells. In the present study, the proteomic approach has been applied to three different cell lines in order to detect new signal transduction molecules. A431 human epithelial cells, MRC5 human fibroblasts, and PC12 cells, derived from a rat pheochromocytoma tumor, were used as models for studying epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and nerve growth factor (NGF), respectively. That strategy led to the identification of 14 proteins. Several of these proteins have been previously directly associated with growth factor stimulation (disulfide isomerase, PCNA, galectin-3, adenosine kinase). Some of the other proteins that have been identified (prohibitin, AHA1, NDRG1, PAK2, EBP1), whose function is known, may be indirectly correlated to growth factors, since their function is in accordance to the consequences of growth factor stimulation to the respective cellular systems. Other proteins, like p47 and tryptophanyl-tRNA synthetase are involved in processes that are also regulated by growth factors, such as RNA splicing and protein synthesis. Finally, cathepsin D, whose function cannot be correlated to growth factors in the absence of other experimental data has also been identified. Semi-quantitative RT-PCR was used for the study of transcription levels of the genes that encode the above proteins. The evaluation of the results showed a statistically significant increase of the NDRG1 mRNA levels upon EGF stimulation. The quantitative alterations observed for the rest of the proteins probably do not result from regulation of the mRNA levels, but are consequences of post-translational modifications, intracellular translocations or other mechanisms involved in post-translational control. Prohibitin, a potential tumor supressor, was further investigated on biochemical aspect because of its important role in cell cycle regulation and protection of mitochondrial proteins from degradation. It was shown that growth factors PDGF and NGF result in opposite effects on prohibitin levels, while the mRNA levels remain unaltered. Western blot analysis showed that despite the fact that the total protein amount is not affected by growth factors, prohibitin’s soluble fraction is reduced upon PDGF stimulation. Immunocytochemistry experiments that have been performed localized prohibitin to the mitochondria of MRC5 fibroblasts in a PDGF-independent manner. The same experiments showed that PDGF stimulates mitochondria translocation to the perinuclear compartment in MRC5 fibroblasts, with subsequent reduction of prohibitin’s solubilization. Moreover, the study of growth factors was focused on Akt biochemical pathway. Multiprotein complexes that are formed with Akt kinase have been isolated in an attempt to detect new molecules that directly interact with this kinase. This set of experiments led to the isolation of the complex that forms Akt with chaperone Hsp90. In addition to that, tubulin has also been identified as an Akt-associated protein. Finally, protein samples that were isolated from lung tissue of Akt3 -/- mice have been studied. It was shown that antioxidant protein 2 (AOP2) is deactivated by the oxidation of the cysteine residue of the catalytic center in Akt3 -/- samples. This modification, in combination with the increased levels of oxidised proteins in knockout samples lead to the conclusion that the absense of Akt3 kinase probably causes oxidative stress to the lung cells. The oxidation of the cysteine residue of the catalytic center of AOP2 to sulfinic acid deactivates the enzyme, since it cannot reduce other oxidised groups, resulting in reduced cell antioxidant protection. Although an increased sensitivity of Akt3 -/- immortalised fibroblasts to the addition of exogenous hydrogen peroxide was not detected, this observation does not necessarily reflect the in vivo situation. In conclusion, the thesis presented here contributed to the study of growth factor-activated signaling pathways and led to the identification of new proteins that are regulated by PDGF, EGF or NGF. Moreover, the Akt pathway was studied by isolating the protein complexes that are formed by Akt kinase and by comparing the protein profile of Akt3 knockout and wild type cells.
περισσότερα