Development of biocatalytic devices with the use of 3D printing and microfludic technology

Abstract

In the present thesis, they were developed methods and protocols under the scope to facilitate biocatalytic processes, with the use of Enzyme immobilization technology, Microfluidic technology, and 3D printing technology. The methods and protocols followed aimed at developing processes and tools that belong to the general area of biotechnology, a wide research field that utilizes biological systems or parts of them and their derivatives to develop useful products and processes for human health, food, energy, and environmental preservation. Biocatalysis utilizes one or more enzymes to convert substrates into higher-value compounds. Nowadays, the trends in biocatalysis follow three main directives: integration of novel technologies, intelligent manufacturing, and enzymatic total synthesis of complex natural products and drugs. As a sub-sector of microfluidic technology, flow biocatalysis, plays a decisive role in the concept of upgrading enzymatic processes, offering process intensification and production yields that could never be realized with conventional technology. The research conducted so far has showed that, when growing out of the beaker, biocatalysis can be highly productive, controlled, and sustainable. Fundamental contribution to these features makes the fusion of enzyme immobilization technology with microreactor systems. The prevailing advantage of immobilization in microfluidic bioreactors is that the catalyst remains in the interior of the microreactor, while reagents and products are continuously pumped in and out of the reaction system, giving the opportunity to develop systems with high operational stability. With extremely low costs and almost infinite design possibilities, 3D printing has been considered to offer completely new ways of thinking about medicine and bioengineering. Publications for bio-based applications of 3D printed prototypes are growing exponentially in the last 5 years, while the first attempts to integrate this technology to the biocatalysis field have been lately witnessed. The ulterior motive of the described works is to use 3D printing technology to build simple and low-cost reactor platforms that will accommodate various enzymes and reach one step closer to industrial applications of biocatalytic processes. The present thesis is divided into two main parts. The first part describes the development of a microreactor with zinc oxide nanowires (ZnO NWs) grown in situ in its inner walls that served as an immobilization platform for β-glucosidase. The system was characterized morphologically and spectroscopically, and its kinetic and stabilization characteristics were evaluated with a series of biocatalytic tests. Glycosylation reactions of plant metabolites tyrosol and perillyl alcohol were also attempted, in order to synthesize valuable compounds concerning the pharmaceutical industry, like perillyl glycoside and salidroside. The results of the study indicated that, compared to studies reported previously with glucosidases in their free or immobilized form, the nano-immobilized enzyme in the case of the ZnO microreactor excels for its ability to be used multiple times, requiring a low reaction time and minimum enzyme amount to achieve sufficient product yields. In the second section, polylactic acid (PLA) was elaborated as a biocompatible and biodegradable 3D printing material, to fabricate enzyme immobilization scaffolds with different final structure depending on the application. Well-plates, with a customizable number of wells, were designed and 3D printed with the aim to serve as screening platforms for several biocatalytic tests that enabled the optimization of a newly presented PLA modification protocol. The versatility of the designed system as a biotechnological tool was highlighted with its application for different enzymes immobilization, along with the conduction of a series of biocatalytic tests to evaluate the performance of immobilized β-glucosidase. In a different approach, microreactors with an internal curvilinear shape were designed and 3D printed in order to be part of a microfluidic system that would facilitate a variety of biotransformation reactions. The performance of the system was evaluated using hydroxytyrosol as a model compound, its biotransformation being of high importance for food, cosmetic, and pharmaceutical industries. High conversion efficiencies for several biophenols from dietary sources were achieved during continuous flow biotransformation with laccase immobilized PLA microreactors, while oligomeric products, that have been previously proved to have important biological activities, were identified with mass spectrometry. The results of this study demonstrate a promising concept for enzyme immobilization scaffold design, elaborating cost-effective and sustainable processes with naturally-sourced compounds. The methods and protocols developed in the context of the present thesis are new entries in biocatalysts design research and are expected to set the groundwork for the development of more advanced biocatalytic tools with increased potential in miscellaneous bio-related applications.

Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα και μεθοδολογίες με στόχο την προώθηση βιοκαταλυτικών διεργασιών, με τη χρήση των τεχνολογιών της Ακινητοποίησης ενζύμων, της Μικρο-ρευστομηχανικής και της 3D εκτύπωσης. Οι μέθοδοι και τα πρωτόκολλα που ακολουθήθηκαν στόχευσαν στην ανάπτυξη διεργασιών και εργαλείων που ανήκουν στον τομέα της βιοτεχνολογίας, ένα ευρύ ερευνητικό πεδίο που χρησιμοποιεί βιολογικά συστήματα ή μέρη αυτών και τα παράγωγά τους για να αναπτύξει χρήσιμα προϊόντα και διεργασίες για την ανθρώπινη υγεία, τη διατροφή, την ενέργεια και την προστασία του περιβάλλοντος. Η βιοκατάλυση χρησιμοποιεί ένα ή περισσότερα ένζυμα για να μετατρέψει υποστρώματα σε ενώσεις με υψηλότερη αξία. Στις μέρες μας, οι τάσεις στη βιοκατάλυση ακολουθούν τρεις κύριες κατευθύνσεις: την ενσωμάτωση καινοτόμων τεχνολογιών, τα ευφυή συστήματα παραγωγής, και την ενζυμική καθολική σύνθεση περίπλοκων φυσικών προϊόντων και φαρμάκων. Ως υπo-πεδίο της μικρο-ρευστομηχανικής, η βιοκατάλυση υπό ροή, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη γενικότερη ιδέα της αναβάθμισης των ενζυμικών διεργασιών, προσφέροντας εντατικοποίηση των διεργασιών και παραγωγικές ικανότητες που δε θα μπορούσαν να επιτευχθούν με τη συμβατική τεχνολογία. Η έρευνα που έχει διεξαχθεί μέχρι τώρα έχει δείξει ότι, όταν αναπτύσσεται έξω από το δοκιμαστικό σωλήνα, η βιοκατάλυση μπορεί να γίνει υψηλά παραγωγική, ελεγχόμενη και αειφόρα. Θεμελιώδης συμβολή στα χαρακτηριστικά αυτά παρέχει η συνένωση της τεχνολογίας ακινητοποίησης ενζύμων με τα συστήματα μικρο-αντιδραστήρων. Το εξέχων πλεονέκτημα της ακινητοποίησης στους βιοαντιδραστήρες μικροροής είναι ότι ο καταλύτης παραμένει στο εσωτερικό του μικροαντιδραστήρα, ενώ τα αντιδραστήρια και τα προϊόντα αντλούνται συνεχώς μέσα και έξω από το σύστημα αντίδρασης, δίνοντας τη δυνατότητα να αναπτυχθούν συστήματα με υψηλή λειτουργική σταθερότητα. Με εξαιρετικά χαμηλά κόστη και σχεδόν απεριόριστες δυνατότητες σχεδιασμού, η 3D εκτύπωση έχει θεωρηθεί ότι προσφέρει εντελώς νέες συλλογιστικές μεθόδους για τους τομείς της ιατρικής και της βιοτεχνολογίας. Οι δημοσιεύσεις με βιολογικές εφαρμογές 3D εκτυπωμένων πρωτοτύπων αυξάνονται εκθετικά τα τελευταία 5 χρόνια, ενώ έχουν πρόσφατα παρατηρηθεί οι πρώτες προσπάθειες να ενσωματωθεί η τεχνολογία αυτή στον τομέα της βιοκατάλυσης. Ο απώτερος σκοπός των μελετών που έχουν περιγραφεί είναι να χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία της 3D εκτύπωσης για να κατασκευαστούν απλές και χαμηλού κόστους πλατφόρμες αντιδραστήρων που θα φιλοξενήσουν διάφορα ένζυμα και θα φτάσουν ένα βήμα πιο κοντά στη βιομηχανική εφαρμογή των βιοκαταλυτικών διεργασιών. Η παρούσα διατριβή διακρίνεται σε δύο βασικά μέρη. Το πρώτο μέρος περιγράφει την ανάπτυξη ενός μικροαντιδραστήρα με νανοράβδους οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO NWs) που έχουν αναπτυχθεί in situ στα εσωτερικά του τοιχώματα και χρησίμευσαν ως πλατφόρμα ακινητοποίησης για το ένζυμο β-γλυκοσιδάση. Το σύστημα χαρακτηρίστηκε μορφολογικά και φασματοσκοπικά, ενώ τα κινητικά χαρακτηριστικά του και οι δυνατότητες σταθεροποίησής του αξιολογήθηκαν με μία σειρά βιοκαταλυτικών ελέγχων. Επιχειρήθηκαν επίσης αντιδράσεις γλυκοζυλίωσης των φυτικών μεταβολιτών τυροσόλη και περιλύλ- αλκοόλη με σκοπό να συντεθούν πολύτιμες ενώσεις που αφορούν τη φαρμακευτική βιομηχανία, όπως ο περιλύλ γλυκοζίτης και το salidroside. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι, συγκριτικά με μελέτες που έχουν αναφερθεί προηγουμένως με γλυκοσιδάσες σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή, το νανο-ακινητοποιημένο ένζυμο στην περίπτωση του ZnΟ μικροαντιδραστήρα εξέχει για την ικανότητα του να χρησιμοποιείται πολλές φορές, απαιτώντας μικρό χρόνο αντίδρασης και ελάχιστη ποσότητα ενζύμου για να επιτευχθεί επαρκής παραγωγή προϊόντος. Στο δεύτερο μέρος, χρησιμοποιήθηκε το πολυγαλακτικό οξύ (PLA) ως ένα βιοσυμβατό και βιοαποδομήσιμο υλικό 3D εκτύπωσης, ώστε να κατασκευαστούν ικριώματα ακινητοποίησης ενζύμων με διαφορετική τελική δομή ανάλογα με την εφαρμογή. Πλακίδια μικροκελιών, με προσαρμόσιμο αριθμό κελιών, σχεδιάστηκαν και εκτυπώθηκαν με στόχο να αποτελέσουν πλατφόρμες διεξαγωγής διάφορων βιοκαταλυτικών ελέγχων, καθιστώντας δυνατή τη βελτιστοποίηση ενός νέου πρωτοκόλλου τροποποίησης του PLA. Η ευελιξία του συστήματος που σχεδιάστηκε ως βιοτεχνολογικό εργαλείο αναδείχθηκε με την εφαρμογή του για την ακινητοποίηση διαφορετικών ενζύμων, παράλληλα με τη διεξαγωγή μίας σειράς βιοκαταλυτικών ελέγχων για την αξιολόγηση της αποδοτικότητας της ακινιτοποιημένης β-γλυκοσιδάσης. Σε μία διαφορετική προσέγγιση, μικρο-αντιδραστήρες με εσωτερικό σιγμοειδές σχήμα σχεδιάστηκαν και εκτυπώθηκαν ώστε να αποτελέσουν μέρος ενός μικρο-ρευστομηχανικού συστήματος που θα προωθούσε μία ποικιλία αντιδράσεων βιομετασχηματισμού. Η αποδοτικότητα του συστήματος με ακινητοποιημένη λακάση, αξιολογήθηκε με τη χρήση της υδροξυτυροσόλης ως πρότυπη ένωση, καθώς ο βιομετασχηματισμός της είναι υψηλής σημασίας για τις βιομηχανίες τροφίμων, καλλυντικών και φαρμάκων. Παράλληλα, επιτεύχθηκαν υψηλές αποδόσεις μετατροπής για διάφορες βιο-φαινόλες από διατροφικές πηγές, κατά τη διάρκεια του βιομετασχηματισμού τους υπό συνεχή ροή με ακινητοποιημένη λακάση σε 3D εκτυπωμένους PLA μικροαντιδραστήρες. Ως αποτέλεσμα των βιομετασχηματισμών αυτών, ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας ολιγομερή προϊόντα που έχουν δειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι διαθέτουν σημαντικές βιολογικές δράσεις,. Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής αναδεικνύουν ένα πολλά υποσχόμενο σενάριο για το σχεδιασμό φορέων ακινητοποίησης ενζύμων, κάνοντας χρήση φθηνών και βιώσιμων διεργασιών με ενώσεις από φυσικές πηγές. Οι μέθοδοι και τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αποτελούν νέες προσθήκες στην έρευνα για τον σχεδιασμό βιοκαταλυτών και αναμένεται να θέσουν τις βάσεις για την ανάπτυξη πιο προηγμένων βιοκαταλυτικών εργαλείων με αυξημένες δυνατότητες για ποικίλες βιο-σχετιζόμενες εφαρμογές.