Ο ρόλος του ομοιοτικού γονιδίου LHX7 στον αναπτυσσόμενο και ενήλικο εγκέφαλο των θηλαστικών

Abstract

Forebrain cholinergic neurons (FCNs) constitute the most rostral subpopulation of cholinergic neurons in the central nervous system and are divided in two groups: interneurons of the striatum and projection neurons of the basal forebrain. FCNs have drawn much attention during the past 50 years, as they are implicated in neurodegenerative diseases (i.e. Alzheimer’s disease) and developmental syndromes characterized by mental retardation (i.e. Rett syndrome). Nevertheless, the genetic mechanisms underlying the development of FCNs are only starting to be elucidated. Most of FCNs are derived from the basal telencephalon, where Lhx7, a LIM-homeobox gene is expressed. In the present study, we analyzed in detail the expression of the Lhx7 gene in the mouse forebrain and the phenotype of mice lacking LHX7 function. For this purpose we employed genetically modified mice heterozygous and homozygous for the mutant allele Lhx7nLacZ. In this allele, part of the Lhx7 gene, including exons 3, 4, 5, and part of exon 6, has been replaced by a LacZ reporter. Using the LacZ reporter, we showed that in heterozygous animals, which have no apparent cellular deficit in the forebrain, β-galactosidase activity reproduces the pattern of expression of the wild type Lhx7 locus. Our results showed that in heterozygous mice, Lhx7 expression is restricted to head regions (i.e. the 1st branchial arch, the basal telencephalon and the anterior hypothalamic area). Expression of the gene first appears around E9.5 in the 1st branchial arch. One day later -around E10.5- Lhx7 expression is detected in the brain and is maintained throughout adulthood. In the adult brain Lhx7 is expressed in the basal forebrain, the striatal compartment of the basal ganglia and in the anterior hypothalamus. In the adult striatum Lhx7 is expressed mainly by cholinergic interneurons, whereas in the basal forebrain it is expressed by cholinergic, as well as GABAergic neurons. Most importantly, all FCNs express the Lhx7 gene. Moreover, we showed that homozygous mutant mice display severe deficits in FCNs: they lack the cholinergic nucleus basalis and show a severe reduction in the number of cholinergic neurons in all subcortical forebrain areas, including the medial septal nucleus, diagonal band nuclei and magnocellular preoptic nucleus and the striatal compartment of the basal ganglia. The severe reduction of cholinergic neurons in the homozygous mutant forebrain is associated with a dramatic decrease of AchE activity in the projection areas of the basal forebrain cholinergic system (i.e. hippocampus and cortex), but no change in muscarinic receptors M1 and M2 binding sites. Using the LacZ reporter as a marker, we also showed that in LHX7-deficient animals, FCN progenitors survive, but fail to generate cholinergic interneurons in the striatum and projection neurons in the basal forebrain. In the absence of LHX7, cells in the striatum normally expressing the gene, appear to acquire a GABAergic phenotype. On the other hand, in the absence of LHX7, cells in the anterior hypothalamic area fail to survive. Interestingly, we showed that at late embryonic stages, Lhx7/LacZ expressing cells are ectopically detected in the cortex of mutants embryos, but we were not able to detect them in the adult homozygous mutant cortex. Moreover analysis of behavior in a series of spatial and non-spatial learning and memory tasks revealed that FCN ablation in homozygous mutant mice is associated with severe deficits in spatial learning and memory. In addition we found no changes in anxiety and locomotor behavior of mutant animals. Overall our experiments demonstrate that Lhx7 expression is required for the specification or differentiation of cholinergic neurons involved in the processing of spatial information.

Οι χολινεργικοί νευρώνες του προσθεγκεφάλου αποτελούν τον πιο πρόσθιο υποπληθυσμό χολινεργικών νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Συνίστανται από δύο υποκατηγορίες: τους χολινεργικούς ενδονευρώνες του ραβδωτού σώματος και τους προβλη- τικούς νευρώνες του βασικού πρόσθιου εγκεφάλου. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 50 ετών, οι χολινεργικοί νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου έχουν αποτελέσει αντικείμενο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας, κυρίως λόγω της εμπλοκής τους σε νευροεκφυλιστικές νόσους (όπως η νόσος Alzheimer) και αναπτυξιακά σύνδρομα που συνοδεύονται από νοητική υστέρηση (όπως το σύνδρομο Rett). Εντούτοις, οι μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη των νευρώνων αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Οι χολινεργικοί νευρώνες του προσθεγκεφάλου πιστεύεται ότι προέρχονται κυρίως από τον βασικό τελεγκέφαλο, περιοχή στην οποία εκφράζεται το LIM-ομοιοτικό γονίδιο Lhx7. Στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε λεπτομερώς την έκφραση του γονιδίου Lhx7 στον εγκέφαλο του ποντικού καθώς και τον φαινότυπο ποντικών από τους οποίους απουσιάζει η λειτουργική πρωτεΐνη LHX7. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν γενετικά τροποποιημένοι ποντικοί, ετερόζυγοι και ομόζυγοι για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο Lhx7nLacZ. Στο αλληλόμορφο αυτό, η περιοχή που περιέχει τα εξόνια 3, 4, 5 και μέρος του εξονίου 6 έχει αντικατασταθεί από το γονίδιο-δείκτη LacZ. Χρησιμοποιώντας το LacZ, δείξαμε ότι στα ετερόζυγα πειραματόζωα -που δεν διαφέ- ρουν από τα φυσιολογικά ως προς τον κυτταρικό τους φαινότυπο- το πρότυπο έκφρασης της β-γαλακτοσιδάσης αναπαριστά το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου Lhx7. Από τη μελέτη μας προκύπτει ότι η έκφραση του γονιδίου Lhx7 περιορίζεται αποκλειστικά σε δομές της κεφαλής και συγκεκριμένα στο πρώτο βραγχιακό τόξο, το βασικό τελεγκέφαλο και τον πρόσθιο υπο- θάλαμο. Η έκφραση του γονιδίου Lhx7πρωτοεμφανίζεται στο πρώτο βραγχιακό τόξο περί- που την εμβρϋική ημέρα 9,5. Στην περιοχή του εγκεφάλου, η έκφραση του γονιδίου Lhx7 πρωτοανιχνεύεται μία ημέρα αργότερα (περίπου την εμβρϋική ημέρα 10,5) και διατηρείται καθόλη τη διάρκεια της ενήλικου ζωής. Στον ενήλικο εγκέφαλο, το γονίδιο Lhx7 εκφράζεται στην περιοχή του βασικού πρόσθιου εγκεφάλου, του ραβδωτού σώματος και του πρόσθιου υποθαλάμου. Στο εν ραβδωτό σώμα ενήλικων πειραματοζώων, το γονίδιο αυτό εκφράζεται κυρίως στους χολινεργικούς ενδονευρώνες, ενώ στον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο τόσο σε χολινεργικούς, όσο και σε GABAεργικούς νευρώνες. Εντούτοις, ιδιαίτερα σημαντική είναι η παρατήρηση ότι όλοι οι χολινεργικοί νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου εκφράζουν το γονίδιο Lhx7. Επιπρόσθετα, από τα πειράματά μας προκύπτει ότι οι ομόζυγοι μεταλλαγμένοι ποντικοί εμφανίζουν σοβαρά ελλείμματα στο χολινεργικό υποσύστημα του πρόσθιου εγκεφάλου: στον εγκέφαλο των ποντικών αυτών παρατηρείται απώλεια των χολινεργικών νευρώνων του βασικού πυρήνα και δραστική ελάττωση του αριθμού των χολινεργικών νευρώνων σε όλες τις υποφλοιώδεις περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου, συμπεριλαμβανομένων του μέσου πυρήνα του διαφράγματος, των πυρήνων της διαγώνιας ταινίας, του μεγαλοκυτταρικού προοπτικού πυρήνα και του ραβδωτού σώματος. Η παρατηρούμενη ελάττωση των χολινεργικών νευρώνων στον πρόσθιο εγκέφαλο των ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών συνοδεύεται από σημαντική μείωση της δραστικότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AchE) στις περιοχές του εγκεφάλου, που προβάλλουν οι χολινεργικοί νευρώνες του βασικού πρόσθιου εγκεφάλου, δηλαδή στον ιππόκαμπο και τον φλοιό. Αντίθετα, δεν βρέθηκαν μεταβολές στα επίπεδα των μουσκαρινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης τύπου Μ1 και Μ2. Χρησιμοποιώντας το δείκτη LacZ, δείξαμε επίσης ότι στον πρόσθιο εγκέφαλο των ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών τα προγονικά κύτταρα των χολινεργικών νευρώνων επιβιώνουν, αλλά αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν σε χολινεργικούς νευρώνες του ραβδωτού σώματος ή του βασικού πρόσθιου εγκεφάλου. Στην περιοχή του ραβδωτού μάλιστα, απουσία του LHX7, τα κύτταρα που τον εκφράζουν φυσιολογικά, φαίνεται να αποκτούν αντί του χολινεργικού, GABAεργικό φαινότυπο. Σε αντίθεση με ότι συμβαίνει στον πρόσθιο εγκέφαλο, στην περιοχή του πρόσθιου υποθαλάμου των ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών, τα κύτταρα που φυσιολογικά εκφράζουν το γονίδιο Lhx7, αποτυγχάνουν να επιβιώσουν. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα είναι επίσης η παρατήρηση ότι σε όψιμα εμβρυϊκά στάδια, κύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης εντοπίζονται έκτοπα στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό των ομόζυγων μεταλλαγμένων εμβρύων, ενώ δεν ανιχνεύονται στον εγκεφαλικό φλοιό ενήλικων μεταλλαγμένων ποντικών. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση της συμπεριφοράς των πειραματόζωων σε μία σειρά από δοκιμασίες που ελέγχουν τις ικανότητες χωρικής και μη-χωρικής μάθησης και μνήμης προκύπτει ότι ο κυτταρικός φαινότυπος των ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών συ- σχετίζεται με διαταραχές στις διαδικασίες χωρικής μάθησης και μνήμης. Τέλος, δεν ανιχνεύτηκαν μεταβολές στα επίπεδα άγχους ή την κινητική συμπεριφορά των ομόζυγων μεταλλαγμένων ποντικών. Συνοψίζοντας, από τα πειράματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι το γονίδιο Lhx7 παίζει καθοριστικό ρόλο στη διαφοροποίηση των χολινεργικών νευρώνων του πρόσθιου εγκεφάλου, που εμπλέκονται στην επεξεργασία πληροφοριών από το περιβάλλον.