Η διελεύκανση των μοριακών μηχανισμών μάθησης και μνήμης με την χρήση μοντέλων γνωσιακών δυσλειτουργιών στην drosophila melanogaster

Abstract

This doctoral thesis is titled "Elucidating the molecular mechanisms of learning and memory using models of cognitive dysfunction in Drosophila melanogaster".The reason it was chosen as a model organism Drosophila is not only one. The Drosophila, although belonging to the class of insects has great advantages over other organisms. Both genetic analysis offered, and the ease of handling are key advantages. Also the dynamic of fly to study the behavior is very large and can be analyzed behaviors similar to those of mammals. So learning and memory in Drosophila studied by the appropriate representative methods, as well as those procedures involved molecules and signaling pathways similar to those of mammals.Learning and memory are very important processes in humans and its survival. Problems in these processes lead to disease, the molecular basis of which it is impossible to elucidate in humans. However, to improve the quality of human life and to combat these diseases, it is necessary to identify and study the function of those molecules that play a role in learning and memory formation, at the level of the neuron. Diseases such as mental retardation, autism, Alzheimer's, Parkinson's disease, various dementias, schizophrenia, migraines, ADHD, various syndromes and many others, have as the main symptom abnormal learning ability and memory. Is therefore understandable how important and necessary it is to elucidate these mechanisms and to highlight the molecular basis underlying the processes of learning and memory.The use of model organisms is essential because only then can we lead nuclei in molecules that underpin the formation of learning and memory. The simulation of some human diseases in model organisms such as Drosophila, allows us to study the deficit behaviors associated with a disease, but also to indulge in depth to discover the real causes that lead to these deficits. Furthermore, through the study of diseases that affect learning and memory, it is possible to identify specific molecules that play a key role in these processes.Achieved so understanding key processes through the study of pathways disrupted and lead to problems in these behaviors. Also with the understanding of these processes and the identification of molecular targets allows us to find new drug targets to improve the quality of life of people who suffer. In this study, we used the FXS for the study of learning and memory, two processes appear problematic in patients with the syndrome. FXS syndrome presents many cognitive problems that we are able to study in Drosophila as well as engages in the pathophysiology of many molecular and signaling pathways, essential in learning and memory.Thus we investigated the role of dFMRP in these procedures and the function of the protein. Found key molecules that interact with the protein and play an important role in learning and memory. We identified pathways that are affected by the lack of protein and have identified their role in learning and memory.Specifically, we showed that the 50% reduction of the protein in the central nervous system and in particular neuronal subsets, as the mushroom bodies (the analogous region of the hippocampus) causes learning and memory deficit, like in mammals. Also showed that these individuals exhibit hyperactivity and defective non-associative learning. However with the reduction of 50% protein, we were able to overcome development problems caused by lack of dFMRP and study their behavioral phenotypes due to reduced levels of the protein alone. Behavioral studies in mice and humans have shown similarly that the reduction leads to deficient dFMRP learning and memory and to hyperactivity. Therefore the fly is a sensitive model to study phenotypes observed in patients and mouse. Problems with learning, memory, hyperactivity and autistic behaviors.Through genetic and pharmacological tools for demonstrating that the FXS play a particularly important role of mGluR levels and levels of cAMP, two molecules that may belong to the same signaling pathway, which is regulated by dFMRP. Also highlight the positive transcriptional regulation of dfmr1 the levels of cAMP via protein kinase A and demonstrated the transcription factor CREB as the molecule passes the information to the genome. Also the protein plays an important role in regulating synaptic levels of mGluR, and even having role repressor. In addition to further confirm that we have studied over the reduction, increased protein levels lead to changes in behavior. We saw that the Behavioural phenotype is due to cAMP, but ultimately not only because we found another path that is affected by the lack of dFMRP, it's Mark. Reducing dFMRP leads to decreased levels of the activated form of MAPK and this appears to be due to negative regulation of phosphatase PP2A by dFMRP. So it appears that FMRP is a key regulator of local protein synthesis at synapses and changes in morphology and function leading to the award of behavioral deficits. Through our experiments, it is understood that the loss of dFMRP results affecting many signaling pathways that communicate with each other culminating behavioral deficits.The study of hyper-mobility of these individuals and pharmacological scan we conducted showed the complexity of the syndrome and the deregulation of many signaling pathways with the loss of dFMRP. It is however necessary to further study the emergence of significant neuronal subsets in which the lack of protein causes the phenotype eg dopaminergic neurons.It is also necessary to further study the target molecule of FMRP and genetic interactions for understanding and designing new drug targets, effective for the wide range of phenotypes syndrome.In this thesis, a large part of the study was devoted to familiarization. The importance of a necessary and possibly deficient habituation to engage and affect learning and is involved in diseases such as schizophrenia, autism, learning problems etc. In a first approach, we were able to show the necessary neural subsets whose function is essential for normal habituation to fly. Thus we have found that the a and b lobes NS is necessary for normal familiarity. Using the model of FXS, we saw that the decrease dFMRP causes deficient habituation (results not shown) and it is likely that the abnormal associative learning and memory, are these people, due to literacy problems (study in progress).In summary, this work has provided many new insights into the role and function of FMRP in the nervous system and the processes of learning and memory. We brought many new molecules - targets which could be used to design new drugs as well studied and some signaling pathways affected by the lack of FMRP and involved in learning and memory. Also, we have found the necessary neuronal subsets wherein the protein needed for normal learning and memory. Finally, we confirmed once again the contribution and necessity fly to space research and demonstrated new research topics for further study.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει τίτλο «Η διελεύκανση των μοριακών μηχανισμών μάθησης και μνήμης με την χρήση μοντέλων γνωσιακών δυσλειτουργιών στην Drosophila melanogaster”. Ο λόγος που επιλέχθηκε η Drosophila σαν οργανισμός μοντέλο δεν είναι μόνο ένας. Η Drosophila, παρότι ανήκει στην κατηγορία των εντόμων παρουσιάζει μεγάλα πλεονεκτήματα έναντι άλλων οργανισμών. Τόσο η γενετική ανάλυση που προσφέρει, όσο και η ευκολία στον χειρισμό αποτελούν βασικά πλεονεκτήματα. Επίσης η δυναμική της μύγας για την μελέτη της συμπεριφοράς είναι πολύ μεγάλη και μπορούν να αναλυθούν συμπεριφορές παρόμοιες με αυτές των θηλαστικών. Έτσι η μάθηση και η μνήμη μελετώνται στην Drosophila με τις κατάλληλες αντιπροσωπευτικές μεθόδους, καθώς επίσης στις διαδικασίες αυτές εμπλέκονται μόρια και σηματοδοτικά μονοπάτια παρόμοια με αυτά των θηλαστικών.Η μάθηση και η μνήμη αποτελούν πολύ σημαντικές διαδικασίες για τον άνθρωπο και την επιβίωσή του. Προβλήματα στις διαδικασίες αυτές οδηγούν σε ασθένειες, η μοριακή βάση των οποίων είναι αδύνατο να διαλευκανθεί στον άνθρωπο. Ωστόσο για να βελτιωθεί η ποιότητα ζωής του ανθρώπου και να καταπολεμηθούν οι ασθένειες αυτές, είναι απαραίτητη η ταυτοποίηση και η μελέτη της λειτουργίας των μορίων εκείνων που παίζουν ρόλο στο σχηματισμό μάθησης και μνήμης, στο επίπεδο του νευρώνα. Ασθένειες όπως η Πνευματική Καθυστέρηση, ο Αυτισμός, η νόσος Αλτσχάιμερ, η νόσος Πάρκινσον, διάφορες άνοιες, η Σχιζοφρένεια, οι ημικρανίες, η διάσπαση προσοχής, διάφορα σύνδρομα και άλλες πολλές, παρουσιάζουν στα κύρια συμπτώματά τους μη φυσιολογική ικανότητα μάθησης και μνήμης. Γίνεται, επομένως κατανοητό, πόσο σημαντική και αναγκαία είναι η διαλεύκανση αυτών των μηχανισμών και η ανάδειξη της μοριακής βάσης που διέπει τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Η χρήση οργανισμών μοντέλων είναι απαραίτητη γιατί μόνο έτσι μπορούμε να οδηγηθούμε στα μόρια-πυρήνες που θεμελιώνουν το σχηματισμό μάθησης και μνήμης. Η προσομοίωση κάποιων ανθρώπινων ασθενειών σε οργανισμούς μοντέλα, όπως η Drosophila, μας επιτρέπει να μελετήσουμε τις ελλειμματικές συμπεριφορές που συνδέονται με μία ασθένεια αλλά και να εντρυφήσουμε σε βάθος ανακαλύπτοντας τα πραγματικά αίτια που οδηγούν στα ελλείμματα αυτά. Επιπροσθέτως, μέσω της μελέτης ασθενειών που επηρεάζουν τη μάθηση και τη μνήμη είναι δυνατός ο εντοπισμός συγκεκριμένων μορίων-κλειδιών που παίζουν ρόλο στις διαδικασίες αυτές. Επιτυγχάνεται έτσι η κατανόηση βασικών διαδικασιών μέσω της μελέτης των μονοπατιών που διαταράσσονται και οδηγούν σε προβλήματα στις συμπεριφορές αυτές. Επίσης με την κατανόηση των διαδικασιών αυτών και τον εντοπισμό των μοριακών στόχων μας δίνεται η δυνατότητα εύρεσης νέων φαρμακευτικών στόχων με σκοπό την βελτίωση της ποιότητας ζωής των ανθρώπων που υποφέρουν. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήσαμε το FXS για τη μελέτη της μάθησης και της μνήμης, δύο διαδικασιών που εμφανίζονται προβληματικές στους ασθενείς με το σύνδρομο. Το σύνδρομο του FXS παρουσιάζει πληθώρα γνωσιακών προβλημάτων, που είμαστε σε θέση να μελετήσουμε στην Drosophila καθώς επίσης εμπλέκει στην παθοφυσιολογία του και πλήθος μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών, βασικών στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης.Έτσι μελετήσαμε το ρόλο της dFMRP στις διαδικασίες αυτές και τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Βρήκαμε βασικά μόρια που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μάθηση και τη μνήμη. Εντοπίσαμε μονοπάτια που επηρεάζονται από την έλλειψη της πρωτεΐνης και ταυτοποιήσαμε το ρόλο τους στη μάθηση και τη μνήμη.Αναλυτικότερα, δείξαμε ότι η μείωση 50% της πρωτεΐνης στο κεντρικό νευρικό σύστημα αλλά και σε συγκεκριμένα νευρωνικά υποσύνολα, όπως αυτά των Μανιταροειδών σωματίων (της ανάλογης περιοχής του ιπποκάμπου) προκαλεί ελλειμματική μάθηση και μνήμη, όπως συμβαίνει και στα θηλαστικά. Επίσης δείξαμε ότι τα άτομα αυτά, παρουσιάζουν υπερκινητικότητα και ελαττωματική μη συνειρμική μάθηση. Ωστόσο με την μείωση της πρωτεΐνης 50%, μπορέσαμε να ξεπεράσουμε τα αναπτυξιακά προβλήματα που προκαλούνται από την έλλειψη της dFMRP και να μελετήσουμε τους συμπεριφορικούς φαινοτύπους που οφείλονται στα μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης και μόνο. Συμπεριφορικές μελέτες σε ανθρώπους και ποντίκια έχουν δείξει παρομοίως, ότι η μείωση της dFMRP οδηγεί σε ελλειμματική μάθηση και μνήμη καθώς και σε υπερκινητικότητα. Επομένως η μύγα αποτελεί ένα ευαίσθητο μοντέλο για μελέτη φαινοτύπων που παρατηρούνται σε ασθενείς και ποντίκι. Προβλήματα μάθησης, μνήμης , υπερκινητικότητας και αυτιστικές συμπεριφορές.Μέσω γενετικών και φαρμακολογικών εργαλείων καταδεικνύουμε ότι για το FXS ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο παίζουν τα επίπεδα του mGluR αλλά και τα επίπεδα του cAMP, δύο μόρια που μπορεί να ανήκουν στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι, το οποίο ρυθμίζεται από την dFMRP. Επίσης αναδείξαμε την θετική μεταγραφική ρύθμιση του dfmr1 από τα επίπεδα του cAMP μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης Α και αναδείξαμε τον μεταγραφικό παράγοντα CREB σαν το μόριο που μεταβιβάζει την πληροφορία στο γονιδίωμα. Επίσης η πρωτεΐνη παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στις συνάψεις ρυθμίζοντας τα επίπεδα του mGluR, και μάλιστα έχοντας ρόλο καταστολέα. Επιπροσθέτως για περαιτέρω επιβεβαίωση μελετήσαμε ότι πέρα από την μείωση, τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης οδηγούν σε μεταβολές της συμπεριφοράς. Είδαμε λοιπόν ότι ο συμπεριφορικός φαινότυπος οφείλεται στο cAMP, αλλά τελικά όχι μόνο, καθώς βρήκαμε ένα ακόμα μονοπάτι που επηρεάζεται από την έλλειψη της dFMRP, αυτό του ΜΑΡΚ. Η μείωση της dFMRP οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα της ενεργοποιημένης μορφής της ΜΑΡΚ και αυτό φαίνεται να οφείλεται στην αρνητική ρύθμιση της φωσφατάσης ΡΡ2Α από την dFMRP. Έτσι φαίνεται ότι η FMRP αποτελεί κύριο ρυθμιστή της πρωτεϊνικής σύνθεσης τοπικά στις συνάψεις ενώ οι αλλαγές στη μορφολογία και τη λειτουργία της σύναψης οδηγούν σε συμπεριφορικά ελλείμματα. Μέσα από τα πειράματά μας γίνεται κατανοητό ότι η απώλεια της dFMRP έχει σαν αποτέλεσμα να επηρεάζονται πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια, που επικοινωνούν μεταξύ τους με τελική κατάληξη τα συμπεριφορικά ελλείμματα. Η μελέτη της υπερ-κινητικότητας των ατόμων αυτών και η φαρμακολογική σάρωση που πραγματοποιήσαμε, κατέδειξε την πολυπλοκότητα του συνδρόμου και την απορύθμιση πολλών σηματοδοτικών μονοπατιών με την απώλεια της dFMRP. Είναι ωστόσο αναγκαία η περαιτέρω μελέτη για την ανάδειξη σημαντικών νευρωνικών υποσύνολων στα οποία η έλλειψη της πρωτεΐνης προκαλεί το φαινότυπο π.χ. ντοπαμινεργικοί νευρώνες.Επίσης είναι αναγκαία η επιπλέον μελέτη των μοριών-στόχων της FMRP και οι γενετικές αλληλεπιδράσεις της με σκοπό την κατανόηση και τον σχεδιασμό νέων φαρμακευτικών στόχων, αποτελεσματικότερων για το ευρύ φάσμα φαινοτύπων του συνδρόμου.Στην παρούσα διατριβή, ένα μεγάλο μέρος της αφιερώθηκε στην μελέτη της εξοικείωσης. Η σημασία της είναι αναγκαία μιας και η ελλειμματική εξοικείωση πιθανώς να εμπλέκεται και να επηρεάζει την μάθηση και εμπλέκεται σε ασθένειες όπως η σχιζοφρένεια, ο αυτισμός, μαθησιακά προβλήματα κ.α.Σε μια πρώτη προσέγγιση, καταφέραμε να δείξουμε τα απαραίτητα νευρωνικά υποσύνολα που η λειτουργία τους είναι σημαντική για την φυσιολογική εξοικείωση στην μύγα. Έτσι ανακαλύψαμε ότι οι α και β λοβοί των ΜΣ είναι απαραίτητοι για την φυσιολογική εξοικείωση. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο του FXS, είδαμε ότι η μείωση της dFMRP προκαλεί ελλειμματική εξοικείωση (αποτελέσματα δεν δείχνονται) και είναι πιθανό η μη φυσιολογική συνειρμική μάθηση και μνήμη, που παρουσιάζουν τα άτομα αυτά, να οφείλεται σε προβλήματα εξοικείωσης (μελέτη σε πρόοδο).Συνοψίζοντας, η συγκεκριμένη εργασία προσέφερε πολλά νέα στοιχεία για τον ρόλο και την λειτουργία της FMRP στο νευρικό σύστημα και τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Αναδείξαμε πολλά νέα μόρια - στόχους που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον σχεδιασμό νέων φαρμάκων καθώς επίσης μελετήσαμε και κάποια σηματοδοτικά μονοπάτια που επηρεάζονται από την έλλειψη της FMRP και εμπλέκονται στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Επίσης, ανακαλύψαμε τα απαραίτητα νευρωνικά υποσύνολα όπου η πρωτεΐνη χρειάζεται για φυσιολογική μάθηση και μνήμη. Τέλος, επιβεβαιώσαμε για μια ακόμη φορά την συνεισφορά και την αναγκαιότητα της μύγας στο ερευνητικό χώρο και αναδείξαμε νέα ερευνητικά θέματα που χρήζουν περαιτέρω μελέτης.