Ο ρόλος του NF-κB και της πρωτεΐνικής κινάσης Pim-2 στην επιβίωση κυττάρων θηλαστικών

Abstract

Normal diploid mammalian cells undergo a finite number of cell divisions in culture, a phenomenon termed cellular senescence. Several possible mechanisms have been suggested to explain the manner in which diploid cells senesce and by which immortal cells evade senescence. In addition to telomere length and telomerase activity, the pRb and p53 pathways are also involved in regulating cellular senescence. Telomere shortening is not the only inducer of the senescent phenotype. Normal cells possess natural defences that minimize the deleterious consequences of mutations, and these safeguards are often disrupted during multistep carcinogenesis. One such safeguard involves antiproliferative responses - growth arrest or premature senescence and apoptosis - to excess mitogenic signalling or oncogenic and oxidative stress. Oncogenic Ras promotes uncontrolled mitogenesis but when overexpressed in primary cells including normal human diploid fibroblasts (HDF) provokes a permanent cell cycle arrest with features of senescence, in the absence of telomere shortening. The NF-kB transcription factors are pivotal regulators of gene expression programs culminating in stress-like responses and the genesis of innate and acquired immunity. They bind to DNA as hetero- or homodimers arising from five possible subunits: p50/p105 NF-kB1, p52/p100 NF-kB2, p65 (RelA), c-Rel and RelB. Cytoplasmic p50/p65 heterodimers are bound to IkBs (NF-kB inhibitors) thereby sequestering them in the cytoplasm of most cells that are not experiencing a stress-like response. Activators of NF-kB mediate the phosphorylation of IkBs resulting in their degradation by the proteosome. NF-kB is then free to translocate to the nucleus and bind DNA leading to the activation of target genes. NF-kB signalling pathway did not appear to diminish during in vitro cellular senescence of HDF, suggesting that NF-kB may be required for cell survival. Furthermore, to address the role of NF-kB on normal in vitro replicative and stress-induced cellular senescence such as induced by oxidative stress, the NF-kB signalling pathway was suppressed using a super repressor and RNA interference. It was demonstrated that suppression of the NF-kB activation pathway provoked premature in vitro replicative and accelerated hydrogen peroxide-induced senescence of HDFs, through the induction of the DNA damage checkpoint response pathway. Knocking-down ΙΚΚβ but not IKKα induced premature senescence suggesting that the canonical pathway of NF-kB was most likely involved in the regulation of cellular senescence. To further address the role of NF-kB on cellular senescence, the classical model of oncogenic RasV12-induced senescence of IMR-90 HDFs was used. To this end, IMR-90 cells were generated to stably express oncogenic RasV12, ΙΚΚβΤ a mutant form of ΙΚΚβ which constitutively activates NF-kB or both genes together. Oncogenic RasV12-induced premature senescence through the induction of hyperproliferative signals, documented by the expression of cyclin D1 and Cdc6, leading to the initiation of a DNA damage checkpoint response, documented by the expression of y-H2AX, phospho-p53 and phospho-Chk2, and to sustained expression of p53-p21Cip1/Waf1. Constitutively activated ΙΚΚβΤ, although did not extend the lifespan of the cells, rescued IMR-90 form RasV12-induced senescence by blocking the initiation of DDR and suppressing the induction of p53-p21Cip1/Waf1 axis. Finally, overexpression of human wild-type Pim-2, a NF-kB target gene, suppressed the dose-dependent Η₂O₂-induced apoptosis of telomerised human fibroblasts, MRC-5TERT, but overexpression of a dominant negative form of Pim-2 failed to do so. The data suggested that Pim-2 is implicated in the survival of cells undergoing oxidative stress. Collectively, the data of the present thesis showed that the activation of NF-kB contributes to the increase in cell survival of normal human diploid fibroblasts exposed to oxidative and oncogenic stress.

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στη γήρανση φυσιολογικών εμβρυϊκών ανθρωπίνων ινοβλαστών, και ειδικότερα: 1. στη φυσιολογική κυτταρική γήρανση (cellular ή replicative senescence), 2. στην επαγόμενη από στρες πρόωρη κυτταρική γήρανση (ή στρεσο-επαγόμενη κυτταρική γήρανση-, stress-induced premature senescence-, SIPS), όπως αυτή που προκαλείται από οξειδωτικό στρες με τη χορήγηση Η₂Ο₂, και 3. στην επαγομένη από ογκογονίδια πρόωρη κυτταρική γήρανση (oncogene-induced senescence ή OIS), όπως αυτή που επάγεται από το ογκογόνο Ha-RasV12. Ως μοντέλο για τη φυσιολογική κυτταρική γήρανση χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικά στελέχη φυσιολογικών ανθρωπίνων εμβρυϊκών ινοβλαστών MRC-5 και IMR-90, τα οποία καλλιεργήθηκαν μέχρι το τέλος του χρόνου ζωής τους (life-span). Αρχικά, αποσαφηνίστηκε πως ο πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας NF-kB είναι επιβιωτικός παράγοντας και δεν μεταβάλλεται κατά την in vitro γήρανση των ινοβλαστών IMR-90. Στη συνέχεια, για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η πορεία ενεργοποίησης του NF-κΒ εμπλέκεται στη φυσιολογική κυτταρική γήρανση των HDFs, υποθέσαμε, ότι η καταστολή ενεργοποίησης του NF-κΒ, θα μας δώσει μια σαφή εικόνα για το ρόλο του ως επιβιωτικού παράγοντα, τόσο κατά τη φυσιολογική κυτταρική γήρανση όσον και στη γήρανση επαγόμενη από στρες, καθώς ο NF-κΒ είναι ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας αποκρίσεων των κυττάρων θηλαστικών σε στρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνεχής ανακαλλιέργεια των φυσιολογικών ινοβλαστών επιφέρει στρες, το οποίο απουσία του NF-κΒ πιθανά οδηγεί στη συνάθροιση βλαβών στο DNA με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της πορείας απόκρισης σε βλάβες στο DNA με την ενεργοποίηση της Chk2 και του τελεστής της p53. Η φωσφορυλίωση της p53 στη Ser 20, απουσία ενεργούς πορείας μεταγωγής σήματος του NF-κΒ, σταθεροποιεί την ογκοπρωτεΐνη που με τη σειρά της οδηγεί στην επαγωγή της p21Cip1/Waf1i ενός γονιδίου-στόχου της. Ο άξονας p53 - p21Cip1/Waf1 είναι η σημαντικότερη πορεία επαγωγής των αντί-πολλαπλασιαστικών αποκρίσεων κυττάρων, και ιδιαίτερα σε φυσιολογικές ινοβλάστες εκείνος που παίζει τον σημαντικότερο ρόλο τόσο στην επαγωγή όσο και στη διατήρηση της κυτταρικής γήρανσης (Lou and Chen, 2006). Προκειμένου να διερευνηθεί αν το Η₂O₂ επιταχύνει την κυτταρική γήρανση των ινοβλαστών MRC-5 που υπερεκφράζουν τον υπερκαταστολέα του NF-kB, IkBaSR, ανιχνεύθηκε η έκφραση της SA-β-Gal στις ινοβλάστες MRC-5Vector και MRC-5kBαSR παρουσία ή απουσία Η₂O₂. Παρατηρήθηκε πως η IkBaSR κατέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επιτάχυνε τη γήρανση των MRC-5 που επάγεται από το Η₂O₂. Για να διερευνηθεί ο ρόλος του NF-kB στην επαγομένη από ογκογονίδια πρόωρη κυτταρική γήρανση (oncogene-induced senescence ή OIS), χρησιμοποιήθηκε το καλά μελετημένο μοντέλο της Ha-RasV12 επαγόμενης κυτταρικής γήρανσης των ινοβλαστών IMR-90. Ενώ η ενεργοποίηση του NF-kB (με την υπερέκφραση της ΙΚΚβΤ που εμφανίζει ιδιοστατική έκφραση/ενεργότητα) δεν επιμήκυνε τη διάρκεια ζωής των κυττάρων IMR90, η συνέκφρασή της ΙΚΚβΤ με το ογκογόνο Ha-RasV12 διέσωσε τις ινοβλάστες από την πρόωρα επαγόμενη κυτταρική γήρανση παρεμποδίζοντας την ενεργοποίηση της πορείας απόκρισης βλαβών του DNA και καταστέλλοντας την επαγωγή της p53 και της p21Cip1/Waf1. Μελετήθηκαν επίσης οι επιδράσεις της Pim-2, μιας δυνητικά αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης που αποτελεί μεταγραφικό στόχο του NF-kB, σε ανθρώπινες τελομερισμένες ινοβλάστες MRC-5TERT. Η υπερέκφραση της αγρίου-τύπου Pim-2 (wt) κατέστειλε πλήρως τη δοσο-εξαρτώμενη απόπτωση επαγόμενη από το Η₂O₂, ενώ η υπερέκφραση μιας κυρίαρχα-αρνητικής μεταλλαγμένης μορφής της Pim-2, Pim-2 (DN), δεν κατέστειλε τη χαρακτηριστική απόπτωση των ινοβλαστών MRC5TERT που επάγεται από το Η₂O₂, υποδηλώνοντας ότι η Pim-2 εμπλέκεται στην επιβίωση των κυττάρων που εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες. Συνολικά, οι μελέτες της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι ο NF-kB συμβάλλει στην αύξηση της επιβίωσης ανθρωπίνων ινοβλαστών που εκτίθενται σε οξειδωτικό και ογκογόνο στρες.