Ανίχνευση του ογκογονιδίου HPV16 E7 σε επιθηλιακά καρκινώματα. Συσχέτιση με την υπερμεθυλίωση στον προαγωγέα του γονιδίου p16

Abstract

Lung cancer is the leading cause of high cancer mortality worldwide. The growing numbers regarding lung cancer incidences during last two decades imply that it is not just a major health problem, but a lung cancer epidemic. Despite the progress in the field of cancer prevention and treatment, the 5-year cancer-free survival of lung cancer patients remains low, mainly because of the advanced stage of the disease at the time of diagnosis and the moderate effectiveness of the therapies available. It is well established that smoking is the major cause of lung cancer, but smoking alone cannot account for all cases, since there is a considerable number of never-smoker patients. Possible explanations seeking for other causes (chemical carcinogens, external radiation or atmosphere pollution) cannot explain these epidemiological data. The progress in molecular biology sheds light on intracellular procedures leading to cancer. In this context, a large number of studies investigate the participation of human papillomavirus (HPV) in lung carcinogenesis. These studies frequently involve the detection of different segments of HPV16 E7 viral oncogene, which is mostly responsible for viral oncogenic activity, together with the HPV16 E6 oncogene. The availability of the HPV vaccine has revived the need to elucidate the involvement of high risk HPV in lung cancer. In parallel, a great effort targets to early diagnosis of lung cancer by establishing new biomarkers for the disease, such as aberrant p16 promoter methylation, which is indicative of epigenetic modifications of the lung tissue. We presently investigated the present of viral sequence elements which are responsible for its oncogenic activity and their association with epigenetic modification in lung cancer. Namely, the presence of one of the principle viral oncogenes HPV16 E7 was systematically investigated and the results were correlated with p16 promoter methylation. Analysis was based on 74 specimens (58 carcinomas and bronchial brushings from lung cancer patients and 16 non-cancerous adjacent lung tissues). In order to investigate the frequently controversial available data on the HPB16 E7 presence in the lung, we designed four different amplification schemes for the detection of overlapping segments of the HPV16 E7 ORF (100-69%). Using these protocols we also tested 65 DNA samples from cervical smears, some of them shown positive for the virus. Analysis of these lung carcinoma samples revealed the complete absence of the entire HPV16 E7 ORF (amplification scheme 1). On the contrary, the results obtained by amplification of the same ORF using primers including external polylinker sequences (amplification scheme, 2) are mostly positive for E7 (47/74, 63.5%) but the resulting products are not virus-specific and are not susceptible, as expected to endonuclease digestion by AvaII and PvuII. Sequencing of 2 of these samples did not reveal the viral presence either. The use of denaturating agents, such as DMSO, highly specific thermo stable polymerases and higher denaturating temperatures did not improve the efficiency of amplification, indicating the absence of the specific target sequences at the ends of the HPV 16 Ε7 ORF. We then designed 2 additional amplification schemes, in which the ends of the E7 ORF, which could form highly structured conformations after denaturation of the double stranded viral sequence, had been eliminated (amplification schemes 3 and 4). These schemes revealed the frequent presence of the two smaller overlapping E7 segments, E7595-E7822 and E7620-E7822 (12/28 positive samples in both cases). In this case the PCR products were susceptible to AvaII and PvuII restriction endonuclease digestion. Agreement of the results obtained for the two truncated amplicons was particularly satisfactory and in only 12.5% the overlapping segment was detected with only one amplification scheme. Sequencing analysis of the resulting truncated amplicons revealed that the expected sequences were present and completely homologous to the expected sequence. E7 oncogene expression study did not demonstrate any evidence of E7 transcriptional activity. It is noteworthy that all four schemes could specifically detect HPV16 E7 in HPV-positive DNA from cervical carcinomas. Regarding p16 methylation status and possible correlation with HPV16 presence in lung carcinomas, statistical analysis revealed no significant correlation. There is however, a notable correlation between HPV16 E7 oncogene presence among cervical scrapes of healthy individuals and smoking. In conclusion, our data reveal that part of the HPV16 E7 oncogene is present in lung carcinomas in a considerable frequency. The evidently conflicting results from different amplification schemes used in the present study for E7 detection are in agreement with the apparently contradictory results reported in previous studies, which showed the absence or very low presence of complete reading frame of the virus in lung cancer, as opposed to the high frequency of viral sequences in lung cancer when part of this frame was targeted for PCR amplification. Furthermore, this study provides a reasonable model for explaining the above conflicting data, based on the analysis of secondary structures of the viral sequences which can be obtained when the virus is denatured. Thus, the present study as well as retrospective analysis of previous studies shows that part of the viral sequence is frequently present in lung cancer, as less frequently in adjacent no-cancerous tissue, but the complete reading frame is rare, or absent in these cases. However, the presence of these sequences is not positively correlated with epigenetic modification of the lung, i.e. methylation of p16. Finally, the above data show that restriction endonuclease analysis or any additional sequence verification method such as sequencing of the PCR products is required for verifying the fidelity of the PCR-obtained data and certifying the reliability of the results. The results of this study show that former infection with a zinc-finger-containing HPV16 E7 sequence, probably remnant of HPV infection, is frequent among lung cancer patients. This fact could influence the activity of other known transcription factors such as c-Myc, which have been previously shown to be the target of HPV incorporation. Thus, it is evident that extended studies regarding the incorporation of E7 oncogene among healthy individuals as well as patients are now required to investigate the impact of HPV in lung carcinogenesis.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Η επίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα παρουσιάζει ιδιαίτερη αύξηση την τελευταία 20ετία λαμβάνοντας διαστάσεις επιδημίας. Παρά την πρόοδο στους τομείς της πρόληψης και της θεραπείας του καρκίνου, η 5ετής επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει πτωχή, κυρίως λόγω του προχωρημένου σταδίου κατά τη διάγνωση και των μέτρια αποτελεσματικών θεραπειών που είναι διαθέσιμες. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το κάπνισμα είναι η κύρια αιτία που οδηγεί σε καρκίνο του πνεύμονα, όμως δεν μπορεί να εξηγήσει όλες τις περιπτώσεις καθώς υπάρχει σημαντικός αριθμός ασθενών που δεν είναι καπνιστές. Οι πιθανοί επιπρόσθετοι παράγοντες κινδύνου που ενοχοποιούνται είναι τα χημικά καρκινογόνα, η ακτινοβολία και η ατμοσφαιρική ρύπανση. Η πρόοδος της μοριακής βιολογίας έχει οδηγήσει στη διαλεύκανση ορισμένων ενδοκυττάριων διαδικασιών που οδηγούν στην καρκινογένεση. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο, υπάρχει ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών που ενοχοποιούν τη συμμετοχή του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) στην καρκινογένεση του πνεύμονα, οι οποίες συχνά εμφανίζουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Οι μελέτες αυτές συχνά αφορούν στην ανίχνευση διαφόρων τμημάτων του ογκογονιδίου Ε7 το οποίο, μαζί με το γονίδιο Ε6, είναι κυρίως υπεύθυνο για την ογκογόνο δράση του ιού. Η ανάπτυξη εμβολίων έναντι του ιού HPV έχει αναθερμάνει το ενδιαφέρον σχετικά με την πιθανή συμμετοχή του ιού στον καρκίνο του πνεύμονα. Παράλληλα, γίνεται μεγάλη προσπάθεια ώστε να αναγνωριστούν καινούριοι μοριακοί δείκτες πρώιμης διάγνωσης του καρκίνου του πνεύμονα, όπως είναι η υπερμεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16, η οποία υποδηλώνει την επιγενετική αλλοίωση στον πνευμονικό ιστό. H παρούσα μελέτη αφορά στη διερεύνηση της παρουσίας στοιχείων της αλληλουχίας του ιού, που θεωρούνται υπεύθυνα για την ογκογόνο δράση του, καθώς και στη συσχέτιση αυτών με επιγενετικές αλλοιώσεις σε καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, έγινε συστηματικός έλεγχος για την ανίχνευση ενός εκ των δύο κυρίων ογκογονιδίων του ιού, του HPV16 E7, και τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τη μεθυλίωση του γονιδίου p16. Συνολικά αναλύθηκαν 74 δείγματα (58 δείγματα καρκινικού πνευμονικού ιστού και βρογχοκυψελιδικών εκπλυμάτων και 16 δείγματα παρακείμενου μακροσκοπικά φυσιολογικού πνευμονικού ιστού). Για να διαλευκανθούν τα αντικρουόμενα, σε ορισμένες περιπτώσεις, αποτελέσματα αναφορικά με την παρουσία του γονιδίου HPV16 E7, σχεδιάστηκαν τέσσερα διαφορετικά πειραματικά πρωτόκολλα προκειμένου να ανιχνευθούν επικαλυπτόμενα τμήματα του πλαισίου ανάγνωσης του ογκογονιδίου Ε7 (100-69%). Τα πρωτόκολλα αυτά ελέγχθηκαν σε δείγματα DNA από 65 τραχηλικά επιχρίσματα, ορισμένα από τα οποία ήταν θετικά για την παρουσία του ιού. Ανάλυση των δειγμάτων από καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο 1 ανέδειξε καθολική απουσία του πλήρους πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου Ε7. Απεναντίας, όταν για τη μεγέθυνση του ίδιου τμήματος χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές που περιείχαν έναν πολυσυνδέτη στα άκρα τους (πειραματικό πρωτόκολλο 2), τα αποτελέσματα ανίχνευσης ήταν σε μεγάλο βαθμό θετικά για την παρουσία του γονιδίου Ε7 (47/74, 63.5%), όμως τα προϊόντα ανίχνευσης δεν ήταν ειδικά, όπως κατέδειξε η αδυναμία πέψης τους με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και AvaII καθώς και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας τους. Η χρησιμοποίηση αποδιατακτικών παραγόντων (DMSO), πολυμεράσης υψηλής πιστότητας και υψηλότερων θερμοκρασιών μετουσίωσης δε βελτίωσαν το αποτέλεσμα της μεγέθυνσης, γεγονός που πιθανότατα υποδηλώνει την απουσία κάποιων από τις αλληλουχίες-στόχους στα άκρα του γονιδίου Ε7. Ακολούθως σχεδιάστηκαν δύο επιπρόσθετα πειραματικά πρωτόκολλα μεγέθυνσης (πειραματικά πρωτόκολλα 3 και 4) από τα οποία παραλήφθηκαν οι περιοχές στα άκρα της αλληλουχίας του Ε7, οι οποίες θα ήταν δυνατόν να εμφανίζουν ιδιαίτερα σύνθετη δευτεροταγή δομή κατά την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA του ιού. Τα πρωτόκολλα αυτά ανέδειξαν την παρουσία δύο μικρότερων τμημάτων του γονιδίου Ε7, των Ε7595-Ε7822 και Ε7620-Ε7822 (και στις δύο περιπτώσεις 12 θετικά από τα 28 δείγματα που εξετάσθηκαν), τα οποία υποβλήθηκαν επιτυχώς σε πέψη με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και AvaII. Η συμφωνία των αποτελεσμάτων μεταξύ των πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης 3 και 4 ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητική και μόνο στο 12.5% των περιπτώσεων το μικρότερο τμήμα του γονιδίου Ε7 ανιχνεύτηκε μόνο με το ένα πειραματικό πρωτόκολλο μεγέθυνσης. Η ανάλυση της αλληλουχίας των προϊόντων των πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης 3 και 4 απέδειξε ότι οι αναμενόμενες αλληλουχίες ήταν παρούσες και εμφάνιζαν πλήρη ομολογία με αυτές του ιού. Είναι αξιοσημείωτο ότι και τα τέσσερα πειραματικά πρωτόκολλα μπορούσαν να ανιχνεύσουν ειδικά το γονίδιο HPV16 E7 σε επιχρίσματα καρκίνου τραχήλου της μήτρας θετικά για τον ιό HPV16. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Ε7, χρησιμοποιώντας τα πειραματικά πρωτόκολλα 2 και 4, δεν κατέδειξε μεταγραφική ενεργότητα του γονιδίου αυτού στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα που εξετάσθηκαν. Σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου p16 και την πιθανή σχέση με την παρουσία του ιού HPV16 στον καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με τα πειραματικά πρωτόκολλα 3 και 4, η στατιστική ανάλυση δεν ανέδειξε σημαντική συσχέτιση. Η μόνη συσχέτιση που είναι αξιοσημείωτη είναι μεταξύ της παρουσίας του γονιδίου Ε7 σε τραχηλικά επιχρίσματα υγιών καπνιστριών γυναικών και της βαρύτητας του καπνίσματος. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη κατέδειξε την παρουσία του ογκογονιδίου HPV16 E7 στον καρκίνο του πνεύμονα σε σημαντικό βαθμό. Τα φαινομενικά αντικρουόμενα αποτελέσματα των διαφορετικών πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη για την ανίχνευση του γονιδίου Ε7, είναι σύμφωνα με τα αντιφατικά αποτελέσματα προηγούμενων μελετών για τις ίδιες περίπου περιοχές που ελέγχθηκαν στην παρούσα μελέτη. Συγκεκριμένα, μελέτες που αφορούσαν στην ανίχνευση του πλήρους πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου Ε7, παρουσίαζαν την πλήρη έλλειψη ή πολύ χαμηλή συχνότητα του ιού σε καρκίνο του πνεύμονα, σε αντίθεση με μελέτες που στόχευαν στον έλεγχο τμήματος του γονιδίου HPV16 E7 και κατέγραφαν την πολύ συχνή παρουσία ιικών αλληλουχιών σε καρκίνο του πνεύμονα. Παράλληλα, η παρούσα μελέτη παρέχει ένα πιθανό μοντέλο που θα μπορούσε να εξηγήσει τις παραπάνω αντιφάσεις, το οποίο βασίζεται στην ανάλυση της πολυπλοκότητας διαμόρφωσης της αποδιαταγμένης αλληλουχίας στόχου. Από την παρούσα μελέτη, λοιπόν, αλλά και από το σύνολο της βιβλιογραφίας συμπεραίνεται ότι τμήμα του γονιδίου HPV16 E7 περιλαμβάνεται συχνά σε καρκίνο του πνεύμονα και σπανιότερα σε παρακείμενο ιστό, αλλά η παρουσία ολόκληρου του πλαισίου ανάγνωσης του ιού είναι σπάνια ή απουσιάζει στα ίδια δείγματα. Ωστόσο, η παρουσία των τμημάτων αυτών δε συσχετίζεται με την παρουσία του ιού και πιθανώς συνδέεται αρνητικά με τη μεθυλίωση στο γονίδιο p16. Τέλος, από τα προαναφερθέντα αποτελέσματα των μελετών προκύπτει ότι για τον τεκμηριωμένο έλεγχο της παρουσίας του ιού είναι απαραίτητη η χρήση δεύτερης μεθόδου ελέγχου του προϊόντος, όπως η επίδραση με ενδονουκλεάσες περιορισμού ή η ανάλυση της αλληλουχίας των προϊόντων. Tα δεδομένα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν ότι μεταξύ των ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του πνεύμονα είναι συχνή η παρελθούσα λοίμωξη με τον ιό, κατάλοιπο της οποίας είναι πιθανότατα η παρουσία τμήματος του ογκογονιδίου HPV16 Ε7, το οποίο περιέχει έναν δάκτυλο ψευδαργύρου. To γεγονός αυτό θα μπορούσε να επηρεάσει τη δράση άλλων γνωστών μεταγραφικών παραγόντων, που είναι βιβλιογραφικά γνωστό ότι αποτελούν στόχο της ενσωμάτωσης του ιού, όπως το c-Myc. Γίνεται λοιπόν φανερό, ότι απαιτούνται εκτεταμένες μελέτες σχετικά με τη συχνότητα παρουσίας, τη θέση και τον τρόπο ενσωμάτωσης του γονιδίου HPV16 E7 τόσο σε ασθενείς όσο και σε μη επεμβατικό υλικό από υγιή άτομα, ώστε να εκτιμηθεί η σημασία των ευρημάτων της τυχόν εμπλοκής του ιού στην καρκινογένεση του πνεύμονα.