Διερεύνηση των HPV ιών στις δυσπλαστικές αλλοιώσεις και τα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της στοματικής κοιλότητας: μοριακή, ιστοχημική, ανοσοϊστοχημική και υπερμικροσκοπική μελέτη

Abstract

Human Papilloma viruses (HPV) have been implicated in uterine cervical cancer development; however their role in oral squamous cell carcinoma (OSCC) development is less well defined. The aim of this study was to examine the prevalence of HPV infection in malignant, potentially malignant and normal oral epithelium and to evaluate the association of HPV with oral carcinogenesis. For this purpose we examined 258 formalin-fixed paraffin-embedded specimens: 35 normal tissues and 50 fibromas with normal epithelium, 53 non dysplastic leukoplakias and 58 dysplastic leukoplakias and malignant lesions and 65 oral squamous cell carcinomas. Fresh tissue specimen was taken from 33 of those patients. Three different techniques were applied on these tissues: nested polymerase chain reaction (NPCR) was applied on 258 tissue specimens for the detection of HPV DNA (L1 and HPV-16 E6 ORFs), immunohistochemistry was applied on 258 tissue specimens for the in situ detection of HPV L1 protein and transitional electron microscopy was applied on the 33 fresh tissue specimens for detection of viral particles. Positive PCR products were sequenced in order to type HPVs. For all cases factors obtained from the patient’s records, such as histologic diagnosis, gender, age, anatomic location, smoking and alcohol drinking, were recorded. HPV was detected in 34,9% of the tissue specimens (90/258) by at least one of the three methods used. Specifically, HPV was detected in 85 of 258 tissues (32,9%) by nested PCR, in 12 of 258 tissues (4,7%) by immunohistochemistry and in 9 of 33 tissues by transitional electron microscopy (28,1%). In detail, by nested PCR HPV L1 DNA was detected in 40% of normal tissues, 40% of fibromas, 35,8% of non-dysplastic leukoplakias, 31,6% of dysplastic leukoplakias and 22,2% of oral squamous cell carcinomas. The HPV viral load of 96,5% of the samples was very low (1 viral copy per 102-104 cells). Higher viral load (> 1 copy per 102 cells) was detected only in 1,8% of dysplastic and 3,2% of cancerous lesions by the use of MY- PCR. HPV16 prevails in all histological groups in 89-100%. HPV13, 56 and 66 were rarely detected. Statistical analysis with X²-test in the whole sample, a negative, weak and statistically significant relation between age and HPV detection was detected. HPV was detected more frequently in younger individuals (≤ 53 years old). In oral carcinomas, a statistically significant relation between HPV L1 DNA positivity and male gender on the one hand and location on the tongue on the other hand was detected. Statistical analysis with Non Linear Principal Component Analysis, it was detected that the combined factors “male, smoking and alcohol” and “older age without HPV” predispose humans to oral malignancy. We conclude that HPV does not seem, from the specific sample examined, to play a substantial role in oral carcinogenesis. It cannot be excluded that HPV could be involved with oral carcinogenesis only in cases with high viral load or at early stages of carcinogenesis through the hit-and-run mechanism.

Ο ιός του Ανθρωπίνου Θηλώματος (HPV) έχει δειχθεί ως ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο ο ρόλος του στην έναρξη του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της στοματικής κοιλότητας δεν έχει διευκρινιστεί επαρκώς. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να υπολογιστεί ο επιπολασμός του ιού HPV στο καρκινικό, δυσπλαστικό, μη δυσπλαστικό λευκοπλασιακό και φυσιολογικό επιθήλιο της στοματικής κοιλότητας και να εκτιμηθεί ο ρόλος του στην καρκινογένεση. Το υλικό αποτέλεσαν 258 παραφινοποιημένα δείγματα στοματικού βλεννογόνου, 35 φυσιολογικά δείγματα, 50 ινώματα, 53 λευκοπλακίες χωρίς δυσπλασία, 58 λευκοπλακίες με δυσπλασία και 65 ακανθοκυτταρικά καρκινώματα. Σε 33 από τους ασθενείς αυτούς έγινε λήψη και φρέσκου ιστού. Στα δείγματα αυτά εφαρμόστηκαν τρεις τεχνικές: η ενφωλεασμένη αντίδραση της πολυμεράσης στα 258 δείγματα για την ανίχνευση του DNA των HPV ιών (L1 και HPV-16 E6 ORFs), η ανοσοϊστοχημεία στα 258 δείγματα για την ανίχνευση της καψιδιακής (L1) πρωτεΐνης του ιού, και η ηλεκτρονική μικροσκόπηση διέλευσης στους 33 φρέσκους ιστούς για την ανίχνευση των σωματιδίων του ιού. Στα θετικά με την ενφωλεασμένη PCR δείγματα ακολούθησε αλληλούχιση του τελικού προϊόντος και τυποποίηση του ιού. Για κάθε περίπτωση καταγράφηκε το φύλο και η ηλικία του ασθενή, η εντόπιση της βλάβης στη στοματική κοιλότητα, το αποτέλεσμα της ιστοπαθολογικής εξέτασης, ο βαθμός βαρύτητας των δυσπλασιών και των καρκινωμάτων καθώς και η χρήση καπνού και η κατανάλωση οινοπνευματωδών ποτών. Ο ιός HPV ανιχνεύτηκε στο 34,9% των δειγμάτων (90/258) με μία τουλάχιστον από τις τρεις μεθόδους. Συγκεκριμένα, ο HPV ιός ανιχνεύτηκε με την ενφωλεασμένη PCR στα 85 από τα 258 δείγματα (32,9%), με την ανοσοϊστοχημεία στα 12 από τα 258 (4,7%) και με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο στα 9 από τα 33 δείγματα (28,1%). Πιο αναλυτικά, με τη μέθοδο της ενφωλεασμένης PCR, το HPV L1 DNA ανιχνεύτηκε στο 40% των φυσιολογικών δειγμάτων, 40% των ινωμάτων, 35,8% των λευκοπλακιών χωρίς δυσπλασία, 31,6% των λευκοπλακιών με δυσπλασία και στο 22,2% των ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων. Το ιικό φορτίο στο 96,5% των δειγμάτων είναι πολύ χαμηλό (1 αντίγραφο ιού ανά 102-104 κύτταρα). Ο HPV16 επικρατεί σε όλες τις ιστολογικές ομάδες στο 89-100%. Με την εφαρμογή της δοκιμασίας Χ² στο συνολικό δείγμα, βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της νεαρής ηλικίας (≤ 53ετών) και της ανίχνευσης του HPV L1 DNA. Στην ομάδα των καρκινωμάτων βρέθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση του HPV L1 DNA με το ανδρικό φύλο και την εντόπιση στη γλώσσα. Στη στατιστική μελέτη με τη Μη Γραμμική Ανάλυση σε Κύριες Συνιστώσες βρέθηκε ότι οι συνδυασμένοι παράγοντες «ανδρικό φύλο, κάπνισμα και αλκοόλ» και «μεγάλη ηλικία χωρίς HPV» προδιαθέτουν τα άτομα προς την κακοήθεια της στοματικής κοιλότητας. Συμπερασματικά καταλήγουμε ότι ο HPV ιός δεν φαίνεται από το συγκεκριμένο δείγμα να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην καρκινογένεση της στοματικής κοιλότητας. Δεν μπορεί να αποκλειστεί το ενδεχόμενο να παίζει ο HPV ιός ρόλο στην καρκινογένεση σε ορισμένες μόνο περιπτώσεις με υψηλό ιικό φορτίο και διάχυτη ανίχνευση του ιού στο επιθήλιο ή να συμμετέχει στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, μέσω του μηχανισμού hit-and-run. Το πολύ χαμηλό ιικό φορτίο σε σημαντικό ποσοστό των δειγμάτων που μελετήθηκαν υποδηλώνει την πιθανότητα δράσης της στοματικής κοιλότητας ως δεξαμενής HPV ιών.