Μοριακή μελέτη του υπεύθυνου για την αγγειογένεση αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθήλιου (VEGF) σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία

Abstract

Angiogenesis is a complex and multistage process that leads to the generation of new blood vessels from preexisting blood vessels. Recent research as well as clinical studies showed that angiogenesis is essential for tumour growth, penetration and metastasis. The role of angiogenesis has been described in almost all human solid tumour, in some of them seems to relate with the prognosis and the process of the disease, and also with the survival of the patients. However, the mechanism that controls angiogenesis has not been elucidated until now. Nowadays, the idea of the “angiogenic switch” is generally accepted, meaning that the fuse of angiogenesis is caused by the disturbance of the dynamic balance between the inducers and the inhibitors of angiogenesis, even though the mechanism that controls this process in a tumour is yet to be clarified. The most significant inducer of angiogenesis is the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), which forms the initial moderator of the physiological and the pathologic angiogenesis. For years now, angiogenesis has been a matter of research mainly for the study of solid tumours. Research for the correlation of angiogenesis and hematologic malignancies is more recent and even though there is clear evidence for a relationship between angiogenesis and some of them, its relationship with Acute Myeloid Leukaemia (AML) is not yet clarified. The first report for the existence of possible correlation between angiogenesis and AML dates back to 1997. From then on several studies took place with the aim to further evaluate the above correlation. However, studies led to contradictory results and consequently the exact role of angiogenesis in AML remains ambiguous. The purpose of this particular research is the study of angiogenesis on patients with AML in order to clarify whether and to what extend it participates in pathogenesis and prognosis of the disease and in the response of patients in the treatment. As well as to clarify the possible correlation between VEGF expression and hematologic findings and prognostic factors. The discrepancy of the results in many papers according to angiogenesis in AML underlined the main motive for this research. We consider that it would be helpful the measurement of VEGF mRNA in all cell types that resident in the bone marrow with the use of Real Time RT-PCR (Real Time Reverse Transcriptase-PCR) method. This method, which applied for first time in the current research for the study of AML patients, is fast, has the advantage of accuracy and repeatability and also provides the quantification of VEGF, even small number of transcripts. Therefore, the results that connote are more credible and appreciable. Forty (40) AML patients were studied at diagnosis and 18 of them in complete hematologic remission after chemotherapy, while 22 healthy individuals used as controls. A) The expression of VEGF was determined in protein level with the use of immunoenzymatic assay ELISA in patient’s serum and in mRNA level in the bone marrow of AML patients with the use of Real Time RT-PCR method. Β) The microvessel density was evaluated by counting the CD34 stained vessels in biopsies of AML patients at diagnosis. The VEGF protein concentration in control group was 69,48 ± 136,04 pg/ml, in AML patients at diagnosis 212,27 ± 214,29 pg/ml and in AML patients in remission 570,18 ± 569,39 pg/ml. In control group and in all patients were found a significant positive correlation between the VEGF concentration and the platelets count, while there was no correlation with other hematologic parameter. Additionally, there seems to be a statistically significant increase in protein concentration in patients with de novo AML compared to patients with secondary AML, and in patients with unfavorable FAB subtype compared to patients with favorable FAB subtype. The mRNA levels of VEGF obtained from patients during diagnosis were statistically significant reduced compared to control group by 4.218 times (p=0.038). For patients that were in remission those levels were similar to those of the normal individuals. Moreover, statistically significant difference was found between patients at diagnosis and patients in remission. More specifically, patients at diagnosis had 3.704 times (p=0.001) lower levels compared to patients in remission. There was found a negative correlation between mRNA levels of VEGF and the percentage of the blasts, while there was no correlation to other hematologic parameters. Nonetheless, there seem to be statistically significant higher levels at patients with de novo ΑML and unfavourable FAB subtype compared to those with secondary AML and unfavourable FAB subtype. What is also worth noting is that a positive correlation between the levels of mRNA and the concentration of the VEGF protein was found in patients at diagnosis and in remission, whilst this correlation was not confirmed for the control group. This finding is probably due to the increased requirement of leukemic cells for survival and proliferation, a fact that could achieved via the translation of mRNA to protein. On the contrary, in control group the absence of correlation it could be explained by the fact that mRNA was composed but remained as a “pool” in the cell waiting the appropriate stimulus from the environment in order to translate to protein. Finally, for the direct evaluation of angiogenesis we determined the microvessel density using the anti-CD34 antigen in 22 AML patients at diagnosis and in 10 individuals with normal bone marrow that were used as controls. In patients at diagnosis the microvessel density were 5,78 ± 3,15 vessels per optical field, while in the control group were 1,61 ± 0,56 vessels per optical field (p=0,013). There was found no correlation between the number of the vessels and the hematologic parameters, the prognostic factors and the VEGF protein concentration or mRNA levels. In conclusion, increased angiogenesis was observed at the diagnosis of AML, as it emerged through the increased microvessel density and the increased levels of VEGF protein in the serum of the patients. The angiogenic factor VEGF was signified in the AML patients at diagnosis both in mRNA level as well as in protein level and it increased even more at patients in remission. It could well be that the increase in the VEGF levels was caused by the fermentations taking place in the microenvironment of the bone marrow with the aim to regenerate itself after chemotherapy, as well as by possible secretion of the factor apart from the leukemic cells and the normal cells, like stromal cells or hematopoietic stem cells of the bone marrow. The molecular mechanism with which VEGF is produced seems to be heterogeneous in AML as well as dependant not only on the release of cytokines and growth factors, but also on its production by several cell types, leukemic or not. According to our results we conclude that neither microvessel density nor VEGF can constitute prognostic factors in AML patients. Furthermore, antiangiogenic therapy, especially this that targets VEGF or its receptors, cannot be confirmed either by our study or others that can be used as a new therapeutic approach in AML.

Η αγγειογένεση είναι µια σύνθετη και πολυσταδιακή διεργασία που οδηγεί στο σχηµατισµό νέων αγγείων αίµατος από το προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο των ιστών. Πρόσφατες πειραµατικές και κλινικές µελέτες απέδειξαν ότι η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την εξέλιξη, τη διεισδυτικότητα και τη µετάσταση του καρκίνου. Ο ρόλος του φαινοµένου της αγγειογένεσης έχει περιγραφεί σε όλους σχεδόν τους συµπαγείς όγκους του ανθρώπου, σε αρκετούς από τους οποίους φαίνεται να σχετίζεται µε την πρόγνωση και την πορεία της νόσου καθώς και µε την επιβίωση των ασθενών, αλλά ο µηχανισµός που ελέγχει τη διαδικασία της αγγειογένεσης δεν έχει διευκρινισθεί µέχρι σήµερα. Είναι γενικά αποδεκτή σήµερα η άποψη του «αγγειογενετικού διακόπτη», ότι δηλαδή το έναυσµα της αγγειογένεσης δίνεται από τη διατάραξη της δυναµικής ισορροπίας των επαγωγέων και των αναστολέων της, αν και ο µηχανισµός που ελέγχει τη διαδικασία της αγγειογένεσης σε έναν όγκο παραµένει αδιευκρίνιστος. Ο πιο σηµαντικός επαγωγέας της αγγειογένεσης είναι ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), ο οποίος αποτελεί πρωταρχικό µεσολαβητή της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης. Η αγγειογένεση επί χρόνια αποτέλεσε αντικείµενο έρευνας κυρίως για τη µελέτη συµπαγών όγκων. Οι βιβλιογραφικές αναφορές για τη συσχέτιση της αγγειογένεσης µε τα νεοπλασµατικά νοσήµατα του αίµατος είναι πιο πρόσφατες και ενώ έχει διευκρινισθεί η σχέση της µε ορισµένα από αυτά, δεν είναι ωστόσο ξεκάθαρη στην Οξεία Μυελογενή Λευχαιµία (ΟΜΛ). Η πρώτη αναφορά για την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης της αγγειογένεσης µε την ΟΜΛ ανάγεται στο 1997. Από τότε ακολούθησαν διάφορες µελέτες όπου γίνεται προσπάθεια να εκτιµηθεί περαιτέρω η συσχέτιση αυτή, τα συµπεράσµατα όµως είναι αντικρουόµενα µε αποτέλεσµα ο ακριβής ρόλος της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ να παραµένει ασαφής. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η µελέτη της αγγειογένεσης σε ασθενείς µε ΟΜΛ ώστε να διασαφηνισθεί εάν και σε ποιο βαθµό υπάρχει συµµετοχή της στην παθογένεια, την πρόγνωση της νόσου και την απάντηση των ασθενών στη θεραπεία, όπως επίσης και η πιθανή συσχέτιση του VEGF µε τα αιµατολογικά ευρήµατα και τους προγνωστικούς παράγοντες. Η ασυµφωνία των αποτελεσµάτων στις περισσότερες µελέτες σχετικά µε τη συσχέτιση της αγγειογένεσης ιδιαίτερα µε την ΟΜΛ, που περιορισµένα έχει µελετηθεί µέχρι σήµερα, αποτέλεσε το κίνητρο για την διασαφήνιση αυτών των διαφορών. Θεωρήθηκε ότι σ’ αυτό θα βοηθούσε ιδιαίτερα, µεταξύ των άλλων µεθόδων και η µέτρηση του mRNA του VEGF στον κυτταρικό πληθυσµό του µυελού των οστών µε την µέθοδο της Real Time RT-PCR (Real Time Reverse Transcriptase-PCR). Η µέθοδος αυτή, που εφαρµόσθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα διατριβή για την µελέτη των ασθενών µε ΟΜΛ, είναι ταχεία, έχει τα πλεονεκτήµατα της ακρίβειας και της επαναληψιµότητας και επιπλέον εξασφαλίζει τον ποσοτικό προσδιορισµό του VEGF, ακόµη και ελάχιστων µεταγράφων και όχι µόνο τον ποιοτικό, όπως έγινε σε προηγούµενες µελέτες. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσµατα που συνάγονται είναι πιο αξιόπιστα και αξιολογήσιµα. Μελετήθηκαν 40 ασθενείς µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση και 18 από αυτούς σε αιµατολογική ύφεση µετά από χηµειοθεραπεία ενώ 22 υγιή άτοµα χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες. Α) Προσδιορίσθηκε η έκφραση του VEGF τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA στον ορό των ασθενών, όσο και σε επίπεδο mRNA στο µυελό των οστών µε τη µέθοδο της Real Time RT-PCR. Β) Έγινε εκτίµηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε οστεοµυελικές βιοψίες ασθενών µόνο κατά τη διάγνωση, χρησιµοποιώντας το αντί-CD34 αντίσωµα που χρωµατίζει κυρίως τα ενδοθηλιακά κύτταρα και υπερτερεί των άλλων µεθόδων. Η συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης στην οµάδα των µαρτύρων ήταν 69,48 ± 136,04 pg/ml, στους ασθενείς κατά τη διάγνωση της νόσου 212,27 ± 214,29 pg/ml ενώ στους ασθενείς στην ύφεση 570,18 ± 569,39 pg/ml. Τόσο στην οµάδα των ασθενών όσο και στην οµάδα των µαρτύρων βρέθηκε να υπάρχει σηµαντική θετική συσχέτιση ανάµεσα στη συγκέντρωση του VEGF και στον αριθµό των αιµοπεταλίων, ενώ δεν βρέθηκε συσχέτιση µε καµία άλλη αιµατολογική παράµετρο. Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει στατιστικά σηµαντική αύξηση της πρωτεΐνης στους ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ σε σχέση µε αυτούς µε δευτεροπαθή και ανάµεσα στους ασθενείς µε δυσµενή υπότυπο κατά FAB σε σχέση µε αυτούς µε ευνοϊκό. Τα επίπεδα mRNA του VEGF βρέθηκαν στους ασθενείς κατά τη διάγνωση στατιστικά σηµαντικά µειωµένα σε σχέση µε τους µάρτυρες κατά 4,218 φορές (p=0,038). Στους ασθενείς σε ύφεση τα επίπεδα αυτά είναι παρόµοια µε των φυσιολογικών ατόµων. Στατιστικά σηµαντική διαφορά των επιπέδων mRNA βρέθηκε µεταξύ των ασθενών κατά τη διάγνωση και των ασθενών σε ύφεση. Οι ασθενείς κατά τη διάγνωση είχαν κατά 3,704 φορές (p=0,001) χαµηλότερα επίπεδα σε σχέση µε τους ασθενείς στην ύφεση. Από την παρούσα µελέτη βρέθηκε αρνητική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων mRNA του VEGF και του ποσοστού των βλαστών, ενώ δεν βρέθηκε συσχέτιση µε καµία άλλη αιµατολογική παράµετρο. Φαίνεται όµως να υπάρχουν στατιστικά σηµαντικά υψηλότερα επίπεδα στους ασθενείς µε de novo ΟΜΛ και δυσµενή υπότυπο σε σχέση µε τους ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ αλλά και ευνοϊκό υπότυπο στην FAB ταξινόµηση. Αξίζει να αναφερθεί ότι τόσο στους ασθενείς κατά τη διάγνωση όσο και στους ασθενείς σε ύφεση βρέθηκε θετική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων mRNA και της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του VEGF, ενώ η συσχέτιση αυτή δεν επαληθεύθηκε στους µάρτυρες. Το γεγονός αυτό πιθανόν να οφείλεται στην αυξηµένη ανάγκη των κυττάρων για επιβίωση και πολλαπλασιασµό, γεγονός που επιτυγχάνεται µέσω της µετάφρασης του mRNA που συντίθεται σε λειτουργική πρωτεΐνη ενώ στην περίπτωση των φυσιολογικών κυττάρων πιθανόν να συντίθεται mRNA, το οποίο όµως παραµένει ως «δεξαµενή» µέσα στο κύτταρο µέχρι να δοθεί το κατάλληλο ερέθισµα από το περιβάλλον για την παραγωγή της πρωτεΐνης. Τέλος, για την άµεση εκτίµηση της αγγειογένεσης έγινε προσδιορισµός της µικροαγγειακής πυκνότητας χρησιµοποιώντας το αντί-CD34 αντίσωµα σε 22 περιπτώσεις ασθενών µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση της νόσου και σε 10 άτοµα µε φυσιολογικό µυελό που χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες. Στους ασθενείς κατά τη διάγνωση η συνολική µικροαγγειακή πυκνότητα ήταν 5,78 ± 3,15 αγγεία ανά οπτικό πεδίο ενώ στους µάρτυρες 1,61 ± 0,56 αγγεία ανά οπτικό πεδίο (p=0,013). ∆εν βρέθηκε να υπάρχει συσχέτιση του αριθµού των αγγείων µε καµία αιµατολογική παράµετρο ή µε κάποιον από τους προγνωστικούς δείκτες της ΟΜΛ, αλλά ούτε και µε τα επίπεδα mRNA ή τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του VEGF. Συµπερασµατικά, παρατηρήθηκε αυξηµένη αγγειογένεση κατά τη διάγνωση της ΟΜΛ, όπως διαφάνηκε µέσω της αυξηµένης µικροαγγειακής πυκνότητας και των αυξηµένων επίπεδων της πρωτεΐνης του VEGF στον ορό των ασθενών. Ο αγγειογενετικός παράγοντας VEGF εκφράσθηκε στους ασθενείς κατά τη διάγνωση της νόσου, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης και αυξήθηκε σηµαντικά στους ασθενείς στην ύφεση. Η αύξηση των επιπέδων του VEGF που παρατηρήθηκε πιθανόν να οφείλεται σε διεργασίες που συµβαίνουν στο µικροπεριβάλλον του µυελού µε σκοπό της αναγέννησή του µετά τη χηµειοθεραπεία, καθώς και στην πιθανή έκκριση του παράγοντα εκτός από τα λευχαιµικά κύτταρα, και από φυσιολογικά κύτταρα, όπως τα στρωµατικά ή τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα του µυελού των οστών. Ο µοριακός µηχανισµός µε τον οποίο παράγεται ο VEGF φαίνεται να είναι αρκετά ετερογενής στην ΟΜΛ και να εξαρτάται τόσο από την απελευθέρωση κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, όσο και από την παραγωγή του από διάφορους κυτταρικούς τύπους, λευχαιµικούς ή µη. Από τα ευρήµατά µας δεν προκύπτουν σαφή συµπεράσµατα ότι τόσο η µικροαγγειακή πυκνότητα όσο και ο VEGF µπορούν να αποτελέσουν προγνωστικούς παράγοντες στους ασθενείς µε ΟΜΛ. Επιπλέον, η αντιαγγειογενετική θεραπεία, που τα τελευταία χρόνια κερδίζει έδαφος στην αντιµετώπιση των νεοπλασµατικών νοσηµάτων, ιδιαίτερα αυτή που στοχεύει τον VEGF, ή τους υποδοχείς του, δεν φαίνεται από τη µελέτη µας, όπως και από άλλες µελέτες, ότι µπορεί να χρησιμοποιηθεί ως νέα θεραπευτική προσέγγιση στην ΟΜΛ.