Μελέτη των πρωτεϊνών της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης σε κληρονομικές και επίκτητες μεμβρανοπάθειες

Abstract

The aim of the study was the determination of the alterations in the protein composition of the RBC membrane and of the protein oxidation level and finally the probable correlation of the detected alterations with the pathophysiology of the diseases. In order to identify the possible alterations a number of experimental procedures were performed: isolation of RBCs, hypotonic lysis of RBCs, isolation of membrane ghosts, extraction of skeleton, SDS-PAGE, western blot immunodetection, estimation of the protein carbonylation levels, and scanning densitometry. In patients with HS the 4.1R protein a/b ratio was reduced and was accompanied by a secondary deficiency (mainly in 4.2 and actin) or excess (mainly in band 6, band 8 and Hb) in one or more proteins and by the presence of aberrant bands. Protein deficiencies, degradation, aggregation and enhanced binding of cytoplasmic components, band 8, hemoglobin and immunoglobulins G to the membrane, as well as increased oxidative index were found in the majority of the HS patients. Proportion of the membrane- and skeleton-bound Hb was characterized by oxidized/denatured globin or hemichromes and crosslinkings. Some HS membranes are deficient in lipid raft proteins and contain sorcin. By the study of samples with Diabetes mellitus (DM) and Diabetic Retinopathy (DR), apart from an increase in band 8 in two samples with Diabetes, and increased band 8 and hemoglobin attached to the membrane in the most of the samples in combination with a decrease in spectrin. In certain samples we observed increased mobility of band 3, as well as ectopic zones of 255 kDa and a zone of low molecular weight (42 kDa). The proteins of the red blood cell membranes of all the diabetic patients show a statistically important increase in carbonylization in comparison to the samples of reference. It is shown for the first time that there are alterations of the proteins of the red blood cell in diabetic patients with DR and in a greater percentage in those who had developed microangiopathy. The comparison between the cases of primary genetic impairments and the secondary/acquired vitiation of the membrane proteins shows that certain alterations (i.e. in the spectrin/hemoglobin complex, vitiations in band 3, band 8 and hemoglobin increase, the oxidative index) are characteristic of red blood cell damages, which are co-spotted in diseases with utterly different pathophysiology.

Στόχος της διατριβής ήταν η εύρεση μεταβολών στη σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, την οξείδωση και η συσχέτισή τους με την παθοφυσιολογία της νόσου. Έγινε λύση των ερυθροκυττάρων, απομόνωση σπεκτρίνης, πέψη ζώνης 3, διαλυτοποίηση της λιπιδικής διπλοστιβάδας και διαχωρισμός του κλάσματος του υπομεμβρανικού σκελετού. Οι πρωτεΐνες μελετήθηκαν με ηλεκτροφόρηση, έγινε ανίχνευση με αντισώματα (κατά Western) και σάρωση των ηλεκτροφορημάτων και των ανοσοαποτυπωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο λόγος 4.1α/4.1β ήταν μειωμένος σε όλους τους ασθενείς με ΚΣ, παρατηρήθηκαν δευτερεύουσες μεταβολές σε πρωτεΐνες (μείωση της 4.2, της ακτίνης και αύξηση της ζώνης 6). Στα δείγματα με πρωτογενή βλάβη στη ζώνη 3 εντοπίστηκε και μείωση της σπεκτρίνης. Παρατηρήθηκε μείωση της ζώνης 4.9, των αγκυρινών και στην πρωτεΐνη 4.1R. Η ζώνη 7 ήταν μειωμένη σε δύο ασθενείς. Το 67% των δειγμάτων με ΚΣ χαρακτηρίζονται από αύξηση της ζώνης 8 και της αιμοσφαιρίνης που είναι προσδεδεμένη στη μεμβράνη. Στην τυπική ΚΣ παρατηρήθηκαν ζώνες υψηλού ΜΒ (255kDa), επιπλέον ζώνες στην περιοχή των σπεκτρινών και των αγκυρινών, αλλά και ζώνες μικρότερου ΜΒ, αυξημένη πρόσδεση αιμοσφαιρίνης στους σκελετούς καθώς και οι ζώνες υψηλού ΜΒ (255 kDa). Ανιχνεύθηκαν οξειδωμένες ή αποδιαταγμένες μορφές αιμοσφαιρίνης στη μεμβράνη και το σκελετό. Υπήρξε αυξημένη πρόσδεση IgG’s και αυξημένη οξείδωση των καρβονυλομάδων των πρωτεϊνών. Τέλος, ανιχνεύθηκε στη μεμβράνη σορκίνη ως συστατικό της ζώνης 8. Στα δείγματα με σακχαρώδη διαβήτη (ΣΔ) με ή χωρίς διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ) παρατηρήθηκε αύξηση στη ζώνη 8, αιμοσφαιρίνη προσδεδεμένη στη μεμβράνη στα περισσότερα δείγματα σε συνδυασμό με μείωση της σπεκτρίνης, αυξημένη κινητικότητα της ζώνης 3 καθώς και έκτοπες ζώνες 255 kDa και μια ζώνη χαμηλού ΜΒ (42 kDa). Οι πρωτεΐνες των ερυθροκυτταρικών μεμβρανών (ΣΔ και ΔΑ) εμφανίζουν αύξηση της καρβονυλίωσης. Η διαφορά στον οξειδωτικό δείκτη ανάμεσα στους διαβητικούς ασθενείς με ΔΑ και στα δείγματα αναφοράς οφείλεται στους ασθενείς που έχουν αναπτύξει παραγωγική ΔΑ. Συγκρίνοντας τις περιπτώσεις πρωτογενών γενετικών βλαβών (ΚΣ) και δευτερογενών/επίκτητων αλλοιώσεων (ΣΔ) των πρωτεϊνών της μεμβράνης φαίνεται ότι ορισμένες μεταβολές (πχ. σύμπλοκο σπεκτρίνης/αιμοσφαιρίνης, αλλοιώσεις της ζώνης 3, αύξηση στη ζώνη 8 και την αιμοσφαιρίνη, οξειδωτικός δείκτης) συν-εντοπίζονται σε ασθένειες με τελείως διαφορετική παθοφυσιολογία.