Κυτταροβιολογική μελέτη μεταγγιζόμενων ερυθροκυττάρων σε συνθήκες αποθήκευσης

Abstract

The aim of this PhD thesis was the cellular study of pRBCs intended to transfusion that have been stored in CPDA units and the further correlation of the results with relevant clinical studies. The results of the study were as follow: 1. The oxidation of the RBC is a part of storage lesion. 2. The hemoglobin is increasingly bound to the membrane and the cytoskeleton during storage. 3. Some of the main integral proteins of the RBC membrane and the lipid raft-associated leave the membrane, but other cytoplasmic ones become membrane-associated. 4. There is evidence of FAS oligomerization. 5. At the same time, proteolytic fragments representing active caspase-8 and -3 were evident. 6. RBCs lose their physiological shape during storage. From the membrane spikes of echino- and shero-echinocytes, microvesicles are released. 7. The microvesicles released in the units of pRBCs had diameter of 50-210nm. The microvesicles that were isolated from units stored for short periods (1-2 days) were smaller than those released after 35 days of storage (137±37nm, statistically important difference). The latter were characterized by tails, membrane gaps and formation of protein aggregates. All the microvesicles collected from "fresh" units and the majority of those collected on the last day of storage contained hemoglobin, so they were RBC-derived. 8. The degree of vesiculation was increased during storage. 9. The vesicles do not contain the skeletal proteins but have actin, band-3 and GpA. 10. By Western blot analysis the vesicles do not contain aquaporin, but contain the lipid raft associated proteins and proteins related to the membrane pathway of classical apoptosis. The vesicles contain proteins related to phagocytosis signaling events. 11. The proteins of the microvesicles were heavily carbonylated in relation to the RBC membrane of origin. In conclusion, the protein oxidation is a probably important part of the storage lesion. During storage, various mechanisms of cell signaling are activated and are mainly related to cell aging, cell clearance and, probably, programmed cell death. The stored RBCs-derived vesicles bear the same signaling components with their parent cells and, as a result, they probably are also post-transfusionally removed by the same mechanisms. In addition, the role of vesiculation seems to be at least of dual importance: a) one negative parameter is associated with the resulted permanent membrane loss, but b) another positive parameter is probably associated with the specific protein composition of the collected vesicles: since they contain harmful, oxidized and high components signaling potential their release during storage may prevent the premature removal or death of otherwise functional RBCs. Recent clinical studies, supporting the practice of using more "fresh" pRBCs for transfusion purposes, especially in critically affected patients, corroborated the results of the present study.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η κυτταροβιολογική μελέτη των συμπυκνωμένων ερυθροκυττάρων (ΣΕ) που προορίζονται για μετάγγιση προκειμένου να βρεθούν οι άριστες συνθήκες συντήρησης ex vivo που εξασφαλίζουν καλή βιωσιμότητα και λειτουργικότητα. Η μεθοδολογία περιλάμβανε απομόνωση και ανάλυση πρωτεϊνών των ΣΕ σε διάφορα χρονικά σημεία της αποθήκευσης με τεχνικές ηλεκτροφόρησης, ανοσοαποτυπώματος κατά Western και μικροσκοπίας (ηλεκτρονικής, φωτονικής και φθορισμού). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως: 1. Η οξείδωση της μεμβράνης, του κυτταροσκελετού και του κυτταροπλάσματος είναι μέρος της αποθηκευτικής βλάβης των ΣΕ. 2. Η αιμοσφαιρίνη μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη αλλά και στον υπομεμβρανικό κυτταροσκελετό. 3. Οι κύριες πρωτεΐνες του ερυθροκυττάρου καθώς και εκείνες που συσχετίζονται με τις λιπιδικές σχεδίες εγκαταλείπουν τη μεμβράνη και άλλες φαίνεται να μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη. 4. Υπάρχουν ενδείξεις ενεργοποίησης του μεμβρανικού μονοπατιού της απόπτωσης. 5. Παρατηρήθηκαν πρωτεολυτικά θραύσματα των κασπασών-8 και -3 που αντιπροσωπεύουν τις ενεργοποιημένες μορφές τους. 6. Τα ΣΕ, καθώς αυξάνει ο χρόνος της αποθήκευσης μετασχηματίζονται αρχικά σε ακανθοκύτταρα και στη συνέχεια σε σφαιρο-ακανθοκύτταρα. 7. Τα μικροκυστίδια που απομονώθηκαν από τους ασκούς των ΣΕ είχαν διάμετρο από 50-210nm ενώ τα μικροκυστίδια που απομονώθηκαν από ασκούς αποθηκευμένους για μία ημέρα ήταν μικρότερα σε μέγεθος (137±37 nm) από αυτά που απομονώθηκαν στο τέλος της αποθηκευτικής περιόδου (35η ημέρα, 137±37nm). 8. Η κυστιδιοποίηση αυξάνει με την πάροδο του χρόνου αποθήκευσης. 9. Τα κυστίδια δεν περιέχουν σκελετικά συστατικά ενώ φέρουν ακτίνη, ζώνη-3 και γλυκοφορίνη-Α. 10. Πειράματα ανοσοεντόπισης έδειξαν την απουσία υδατοπορίνης στα κυστίδια, την παρουσία πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις λιπιδικές σχεδίες, πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μεμβρανικό μονοπάτι της απόπτωσης και πρωτεΐνες που συμμετέχουν αρνητικά ή θετικά σε πορείες κυτταρικής εκκαθάρισης. 11. Οι κυστιδιακές πρωτεΐνες βρέθηκαν σε μεγάλο βαθμό καρβονυλιωμένες. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης περιέγραψαν τη σταδιακή αναδιαμόρφωση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης που λαμβάνει χώρα κατά την αποθήκευση. Η πρωτεϊνική οξείδωση φαίνεται να συνιστά σημαντικό καθοριστή της αποθηκευτικής βλάβης των ΣΕ. Κατά την αποθήκευση ενεργοποιούνται διάφοροι μηχανισμοί κυτταρικής σηματοδότησης, που σχετίζονται με τη γήρανση, την εκκαθάριση και ίσως τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο των ερυθρών. Τα κυστίδια που παράγονται στον ασκό φέρουν τα ίδια σηματοδοτικά συστατικά με τα κύτταρα προέλευσης τους. Επιπρόσθετα, ο ρόλος της κυστιδιοποίησης κατά την αποθήκευση φαίνεται να είναι διττός: αφενός μεν είναι αρνητικός καθώς προκαλεί μη-αντιστρεπτή μείωση της κυτταρικής επιφάνειας, από την άλλη όμως εξασφαλίζει στο ερυθροκύτταρο την απομάκρυνση οξειδωμένων και επιζήμιων συστατικών τα οποία θα προκαλούσαν τον πρώιμο θάνατο των ερυθροκυττάρων στους ασκούς της μετάγγισης. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής επιβεβαιώθηκαν πρόσφατα από κλινικές μελέτες που υποστηρίζουν τη χρήση φρέσκων ασκών για μετάγγιση ειδικά σε ασθενείς που είναι ανοσοκατεσταλμένοι ή βρίσκονται σε μονάδες εντατικής θεραπείας.