Διερεύνηση της αντοχής στα αντιβιοτικά των S.Aureus and enterococcus spp με προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης και με μοριακές τεχνικές

Abstract

The aim of this doctoral thesis was the investigation of antibiotic resistance of S. aureus and Enterococcus spp. clinical strains. Initially, we have studied resistance to various antibiotics by the use of classic microbiological methods and more precisely, by the determination of minimal inhibiting concentration (MIC). Additionally, for the detection of mecA gene, mediating resistance of S. aureus to β-lactams and van genes, mediating resistance of Enterococcus spp. to glycopeptides, we have applied two molecular techniques: a multiplex PCR and a commercial method combining PCR and reverse hybridization (GenoType MRSA, HAIN- Lifescience). We have studied antibiotic resistance of S. aureus and Enterococcus spp strains which were isolated from cultures of various clinical specimens of patients admitted to Ioannina University Hospital during the period 2000-2008. A total number of 2771 S. aureus and 2317 Enterococcus spp strains were examined. For the identification and susceptibility testing of all these strains we have used the Vitek 2 System (BioMérieux, Marcy l’ Etoile, France). Resistance of S. aureus strains to methicillin was also examined by the use of 30 μg cefoxitin discs. Those strains that were characterized as methicillin-resistant by these two conventional methods, were subsequently examined by the above mentioned two molecular methods. According to our results, sensitivities of the Vitek 2-MIC and cefoxitin disc diffusion test were 98.5 and 99.6 % respectively. Those Enterococcus spp. strains appearing to have absolute or relative glycopeptideresistance according to the Vitek 2 System, were subsequently examined by two molecular methods. The sensitivity of the Vitek 2 System was 83.5%. Statistical analysis of resistance percentages to other classes of antibiotics between MRSA and MSSA strains has shown statistically significant differences between these two groups. Significant differences were also observed between GRE and GSE strains, regarding resistance percentages to Ampicillin and Gentamicin (HLR). In conclusion, the use of the conventional microbiological methods for the detection of methicillin resistance in S. aureus and glycopeptide resistance in Enterococcus spp. proved to be problematic, while molecular techniques proved to be the methods of choice.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της αντοχής κλινικών στελεχών Staphylococcus aureus και Enterococcus spp. στα αντιβιοτικά. Αρχικά, μελετήθηκε η αντοχή σε διάφορα αντιβιοτικά με τη χρήση κλασσικών μικροβιολογικών μεθόδων και ειδικότερα με τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (minimal inhibiting concentration - MIC). Επιπλέον, για την ανίχνευση του mecA γονιδίου, του υπεύθυνου για την αντοχή του S. aureus στα β-λακταμικά αντιβιοτικά και των van γονιδίων, υπεύθυνων για την αντοχή των Enterococcus spp. στα γλυκοπεπτίδια, εφαρμόσθηκαν δύο μοριακές τεχνικές: μια multiplex PCR και ένας συνδυασμός PCR-ανάστροφου υβριδισμού (Genotype MRSA, Genotype VRE, Hain Lifescience). Μελετήθηκε η αντοχή στα αντιβιοτικά στελεχών Staphylococcus aureus και Enterococcus spp., τα οποία απομονώθηκαν από καλλιέργειες διαφόρων κλινικών δειγμάτων ασθενών, οι οποίοι νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ιωαννίνων (Π.Γ.Ν.Ι.) κατά τη χρονική περίοδο 2000-2008. Μελετήθηκαν συνολικά 2.771 στελέχη S. aureus και 2.317 στελέχη Enterococcus spp. Σε όλα τα στελέχη, τόσο για την ταυτοποίησή τους, όσο και για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας τους στα αντιβιοτικά, χρησιμοποιήθηκε αρχικά το σύστημα VITEK II (Biomerieux). Η αντοχή των στελεχών S. aureus στην μεθικιλλίνη ελέγχθηκε παράλληλα με τη χρήση δισκίων κεφοξιτίνης των 30 μg. Όσα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως μεθικιλλίνη-ανθεκτικά με τις ανωτέρω μεθόδους, ελέγχθηκαν στη συνέχεια με δύο μοριακές μεθόδους. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η ευαισθησία του συστήματος Vitek II-MIC και της δοκιμασίας των δίσκων κεφοξιτίνης υπολογίστηκε σε 98.5% και 99.6% αντίστοιχα. Όσα στελέχη Enterococcus spp. εμφάνιζαν σχετική ή απόλυτη αντοχή στα γλυκοπεπτίδια σύμφωνα με το σύστημα Vitek II ελέγχθηκαν με δύο μοριακές μεθόδους. Η ευαισθησία του συστήματος Vitek II υπολογίστηκε σε 83.5%. Η στατιστική ανάλυση των ποσοστών αντοχής στα υπόλοιπα αντιβιοτικά μεταξύ MRSA και MSSA έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο αυτών ομάδων. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και μεταξύ GRE και GSE όσον αφορά τα ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη και στην γενταμυκίνη (HLR). Συμπερασματικά, η χρήση των κλασσικών μικροβιολογικών μεθόδων για την ανίχνευση γονιδίων αντοχής του S. aureus στη μεθικιλλίνη και του Enterococcus spp. στα γλυκοπεπτίδια, απεδείχθη προβληματική, ενώ οι μοριακές τεχνικές αποδείχθηκαν μέθοδοι εκλογής.