Μελέτη ενδιαμέσων μιτωτικών σημάτων και αλλαγών στη γονιδιακή έκφραση με τη χρήση επαγόμενων κυτταρικών συστημάτων έκφρασης του ογκογονιδίου ras

Abstract

Cancer is a disease where the fundamental rules of cell behavior break down. The development of cancer could be due to abnormal expression or function of specific cellular genes like oncogenes (e.g.Ras). In this thesis we describe the Ras expression and we study the signaling events following H-Ras activation. The gene expression profile analysis of Ras using macroarrays is a second goal of this thesis that gives us the opportunity of examining the target genes that are related to initiation and/or maintenance of carcinogenesis. It is worth mentioning that the RAS mutations are restricted to a single RAS gene and are often tissue specific or dependent upon cancer type. Thus, Ras helped us to characterize downstream events and to identify signaling factors that regulate the expression of genes that are involved in cell death, cellular growth and transformation. To examine early signaling events following the Ha-RASV12 activation [a constitutively active mutated form of the protein with substitution of Gly to Val (12)] and the effect of expression towards cell proliferation, a constitutive expression system of Ras and an ecdysone inducible expression system were developed in HEK - 293 human epithelial kidney cells. The Ecdysone inducible system uses a heterodimer of the ecdysone receptor (VgEcR) and the retinoid X receprtor (RXR) that binds 5 modified ecdysone response elements in the presence of a steroid hormone, ponasterone A, to activate expression of the transfected gene. Thus, to examine early Ras signaling events towards cell proliferation and cell death, the ecdysone inducible expression system of Ha-RASV12 was used (293indRas cells). This inducible expression system of oncogenic Ras under low serum conditions 180 induced biological functions such as growth arrest, cellular senescence and apoptosis. Moreover, the inducible expression of HaRASV12 under low serum conditions led to transient activation of MAPK. We also used a second system in which Ha-RASV12 oncoprotein (293conRas cells) is constitutively expressed under normal serum conditions and in which the transformation process is induced in a larger fraction than in 293indRas cells. In order to validate the cellular properties resulting from the oncogenic expression of HaRASV12 in transformed HEK-293 cells expressing Ras either in an inducible manner at an early stage (2 hours post induction with ponasterone) or intermediate stage (6 hours post induction with ponasterone) or in a constitutive manner (293conRas), gene expression profile analysis was performed by using a human oncoarray cDNA. In parallel, early genes that are regulated specifically after Ras induction and not after induction by serum were identified. Thus genes related to all cell functions were revealed. It was observed that target genes that are upregulated from Ras signaling can act independently or cooperate with each other to trigger early, intermediate and late Ras events. In conclusion, we refer to identification of early genes such as the proline oxidase (POX) gene that has not been previously been reported in Ras signaling. These genes could be further studied in the near future as potentially novel targets for therapy in Ras bearing tumors.

Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια όπου οι βασικοί κανόνες της κυτταρικής συμπεριφοράς αναιρούνται. Η ανάπτυξη του καρκίνου μπορεί να είναι αποτέλεσμα της μη ομαλής έκφρασης ή λειτουργίας ειδικών κυτταρικών γονιδίων όπως τα ογκογονίδια (π.χ. ras). Στην παρούσα διατριβή περιγράφουμε την έκφραση του RAS και την μελέτη της μεταγωγής σήματος που ακολουθούν την ενεργοποίηση της HRAS με τα μετέπειτα στάδια της μεταγωγής μηνυμάτων από τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Η ανάλυση έκφρασης των γονιδίων-στόχων του RAS με την χρήση μακροσυστοιχιών γονιδίων (gene expression profile analysis – macroarrays) είναι ένας δεύτερος σκοπός της διατριβής αυτής που δίνει την δυνατότητα μελέτης γονιδίων-στόχων που σχετίζονται με την έναρξη, εξέλιξη ή/και διατήρηση του νεοπλάσματος. Aξίζει να αναφερθεί ότι οι μεταλλάξεις στο RAS συνήθως περιορίζονται σε ένα από τα ras γονίδια και συχνά εξαρτώνται από τον ιστό ή τον τύπο του καρκίνου. Έτσι, το oγκογονίδιο RAS μας βοήθησε να χαρακτηρίσουμε καθοδικά γεγονότα και να ταυτοποιήσουμε παράγοντες σηματοδότησης που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο, την κυτταρική ανάπτυξη και μετασχηματισμό. Προκειμένου να μελετηθούν τα πρώιμα γεγονότα μεταγωγής σήματος που ακολουθούν την ενεργοποίηση της Ha-RAS (V12) (μιας μεταλλαγμένης συνεχώς ενεργού μορφής της πρωτεΐνης με αντικατάσταση βαλίνης αντί γλυκίνης στην θέση 12) και η επίδραση της έκφρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χρησιμοποιήθηκαν συστήματα μόνιμης έκφρασης του RAS και το σύστημα επαγωγής έκφρασης εκδυσόνης, τα οποία μελετήθηκαν σε ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ-293. Το σύστημα εκδυσόνης χρησιμοποιεί ένα ετεροδιμερές από τον υποδοχέα εκδυσόνης (VgEcR) και τον υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος RXR, που προσδένεται σε μια τροποποιημένη λειτουργία αναγνώρισης ΕcRE παρουσία της ορμόνης της ποναστερόνης Α, η οποία επάγει την έκφραση του γονιδίου με το οποίο 177 έχει γίνει η επιμόλυνση. Έτσι, για να εξεταστούν πρώιμα γεγονότα της ογκογενούς RAS σηματοδότησης ως προς την κυτταρική ανάπτυξη και κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήθηκε το επαγόμενο σύστημα του Ηa-RASV12 έκφρασης εκδυσόνης (293indRas κύτταρα). Αυτό το επαγόμενο σύστημα έκφρασης του ογκογενούς RAS σε χαμηλό ορό προσομοιάζει βιολογικές λειτουργίες όπως η ανάσχεση, η κυτταρική γήρανση και η απόπτωση. Επιπλέον, η επαγόμενη ενεργοποίηση του Ηa-RASV12 σε συνθήκες χαμηλού ορού οδήγησε στην περιοδική ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ. Χρησιμοποιήσαμε επίσης ένα δεύτερο σύστημα, όπου η ογκοπρωτεΐνη Ha-RASV12 (293conRas) εκφράζεται μόνιμα σε κανονικό ορό και προσομοιάζει την διαδικασία του μετασχηματισμού περισσότερο απo ότι το 293indRas.