Η δράση των διφωσφονικών στην οστική απορρόφηση και λειτουργία των οστεοβλαστών: ο ρόλος της PTHrP / PTHrP receptor

Abstract

Αναλύσαμε τις δράσεις του ζολεδρονικού οξέος σε συγκεντρώσεις 10-250 μM επί των MG-63 ανθρώπινων κυττάρων οστεοσαρκώματος που ομοιάζουν των οστεοβλαστών, τόσο μετά από συνεχή έκθεση (48-96 ώρες) όσο και μετά από κατά ώσεις (μερική) έκθεση στο ζολεδρονικό οξύ (15 λεπτά /ημέρα για 3 συνεχόμενες ημέρες). Επετεύχθει αναστολή του πολλαπλασιασμού των MG-63 κυττάρων είτε μετά από συνεχή έκθεση είτε μετά από μερική έκθεση στο ζολεδρονικό οξύ, με τρόπο δοσοεξαρτώμενο, ενώ η χρήση EDTA δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στην ίδια δόση και κατά τις ίδιες χρονικές περιόδους. Το ζολεδρονικό οξύ δεν έδειξε αποπτωτική δράση επί των MG-63 κυττάρων όταν χορηγήθηκε σε δόση 100 μΜ για 48 ώρες. Παρόλα αυτά η αποπτωτική δράση εμφανίστηκε μετά από έκθεση διάρκειας 96 ωρών σε δόση 100 μΜ Ζολεδρονικού οξέος. Το ζολεδρονικό οξύ (100 μΜ) αύξησε την κατανομή των κυττάρων MG-63 στην G0/ G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, όμως δεν αύξησε την απόπτωση που προκλήθηκε από την αδριαμυκίνη. Επιπλέον, η αναστολή των κυττάρων MG-63 από το ζολεδρονικό οξύ εξουδετερώθηκε μερικώς από την εξωγενή χορήγηση geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), όχι όμως από την χορήγηση της farnesyl pyrophosphate (FPP). Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι η χορήγηση ζολεδρονικού οξέος στα 100 μΜ για 0, 24 ώρες, 48 ώρες και για 96 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την εξασθένηση της πρενυλίωσης της πρωτείνης Ras και την ενίσχυση της μη πρενυλιωμένης μορφής της Ras (μη ενεργή μορφή κυτοσολίου). Η έκθεση των κυττάρων MG-63 cells στα 100 μΜ ζολεδρονικού οξέος και στα 100 μΜ του EDTA είχε ως αποτέλεσμα την γρήγορη αύξηση της έντασης φθορισμού , που ξεκάθαρα δείχνει την ενδοκυττάρια αύξηση του [Ca2+]. Η ενδοκυττάρια αύξηση του [Ca2+] συνέβη μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα και στο ίδιο μέγεθος μετά την προσθήκη είτε ζολεδρονικού οξέος είτε EDTA, δείχνοντας την χηλική ικανότητα αυτών των παραγόντων, που με την σειρά τους οδήγησαν σε ανταπόκριση τα κύτταρα MG-63. Αυτή η αύξηση οφείλεται στην αποδέσμευση του [Ca2+] από τις ενδοκυττάριες αποθήκες, αφού το ζολεδρονικό οξύ απέτυχε να οδηγήσει σε τέτοια αποδέσμευση, όταν στα κύτταρα είχε προηγουμένως χορηγηθεί καφεϊνη 1mM. Επιπλέον, το ζολεδρονικό οξύ μείωσε σημαντικά την έκφραση του οιστρογονικού υποδοχέα ERα, ενώ δεν άλλαξε την έκφραση του οιστρογονικού υποδοχέα ERβ, των κυττάρων MG-63. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ζολεδρονικό οξύ ασκεί έλεγχο στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων που ομοιάζουν του οστεοσαρκώματος. Το πεπτίδιο σχετιζόμενο με την παραθορμόνη (PTHrP) και ο υποδοχέας τύπου Ι της PTHrP (PTH.1R) είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν μία σειρά από τοπικές παρακρινείς/ αυτοκρινείς και ενδοκρινείς λειτουργίες σε διάφορους ιστούς και είναι δυνατόν να τροποποιούν τις δράσεις των φαρμακευτικών παραγόντων στα όργανα στόχους τόσο in vivo όσο και in vitro. Είναι γνωστό ότι οι φυσιολογικές λειτουργίες της PTHrP περιλαμβάνουν την ρύθμιση του μυικού τόνου, την μεταφορά ασβεστίου ενδοεπιθηλιακά και την ανάπτυξη των ιστών και των οργάνων. Όμως έχουν παρατηρηθεί συστηματικές δράσεις της PTHrP σε αρκετές παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Η PTHrP παρουσιάζει, όπως και η PTH, ισχυρή σύνδεση με τον υποδοχέα Ι της παραθορμόνης. Επίσης, οι παράγοντες που επηρεάζουν το μικροπεριβάλλον του οστού όπως ο IGF 1, TGF β1, o βασικός παράγοντας ανάπτυξης των ινοβλαστών (bFGF) καθώς και η ιντερλευκίνη 6 (IL6) μπορούν να επιδράσουν στα κυτταροτοξικά φάρμακα. Ένα από τα σημεία που ελέγχονται σε αυτήν την εργασία είναι η επίδραση του ζολεδρονικού οξέος επί του πεπτιδίου του σχετιζόμενου με την παραθορμόνη καθώς και επί του υποδοχέα της. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ζολεδρονικό οξύ μειώνει την έκφραση της PTHrP τόσο με την μέθοδο RT PCR όσο και με την μέθοδο ανοσοφθορισμού, ενώ δεν επηρεάζει τον υποδοχέα της PTH.1R.