Περίληψη
Ο Mac1 αποτελεί χαλκορυθμιζόμενο, μεταγραφικό παράγοντα του Saccharomyces cerevisiae. Προσδένεται σε ειδικές αλληλουχίες DNA και ρυθμίζει γονίδια (π.χ. CTR1, CTR3, FRE1, FRE7), οι πρωτεΐνες των οποίων είναι υπεύθυνες για την είσοδο του χαλκού στο κύτταρο. Η λειτουργικότητα του Mac1 επηρεάζεται αρνητικά από την παρουσία ιόντων χαλκού και πιθανόν τροποποιείται μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (Voutsina et al., 2001). Για ανεύρεση τέτοιων πρωτεϊνών πραγματοποιηθήκαν πειράματα σάρωσης γενωμικής βιβλιοθήκης με την τεχνολογία των δύο υβριδίων στη ζύμη (Bilsland et al., 2004; Voutsina et al., 2005). Μεταξύ των αλληλεπιδρώντων βρέθηκε η πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη Rad9 και η τσαπερόνη ιστονών Hir1. Η Rad9 ανήκει στην κατηγορία των πρωτεϊνών ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και είναι απαραίτητη στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση, όταν το DNA υποστεί βλάβη (σπάσιμο της δίκλωνης αλυσίδας) από ακτινοβόληση με ακτίνες Χ. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η Rad9, εκτός α ...
Ο Mac1 αποτελεί χαλκορυθμιζόμενο, μεταγραφικό παράγοντα του Saccharomyces cerevisiae. Προσδένεται σε ειδικές αλληλουχίες DNA και ρυθμίζει γονίδια (π.χ. CTR1, CTR3, FRE1, FRE7), οι πρωτεΐνες των οποίων είναι υπεύθυνες για την είσοδο του χαλκού στο κύτταρο. Η λειτουργικότητα του Mac1 επηρεάζεται αρνητικά από την παρουσία ιόντων χαλκού και πιθανόν τροποποιείται μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (Voutsina et al., 2001). Για ανεύρεση τέτοιων πρωτεϊνών πραγματοποιηθήκαν πειράματα σάρωσης γενωμικής βιβλιοθήκης με την τεχνολογία των δύο υβριδίων στη ζύμη (Bilsland et al., 2004; Voutsina et al., 2005). Μεταξύ των αλληλεπιδρώντων βρέθηκε η πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη Rad9 και η τσαπερόνη ιστονών Hir1. Η Rad9 ανήκει στην κατηγορία των πρωτεϊνών ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και είναι απαραίτητη στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση, όταν το DNA υποστεί βλάβη (σπάσιμο της δίκλωνης αλυσίδας) από ακτινοβόληση με ακτίνες Χ. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η Rad9, εκτός από τον ρόλο της ως πρωτεΐνη ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoint protein), έχει ένα νέο ρόλο στην εξαρτώμενη από την RNA πολυμεράση II-μεταγραφή. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η Rad9 αλληλεπιδρά άμεσα μέσω της BRCT επιικράτειάς της με τον χαλκορυθμιζόμενο μεταγραφικό παράγοντα Mac1 επιδρώντας αρνητικά τόσο στην δυνατότητα πρόσδεσης του στο DNA όσο και στην μεταγραφική του δυνατότητα. Επιπλέον βρήκαμε την Rad9 να στρατολογείται στα ρυθμιζόμενα από τον Mac1 γονίδια και μάλιστα η στρατολόγησή της να εξαρτάται από τον Mac1. Η στρατολόγηση της δε, δεν περιορίζεται μόνο στον υποκινητή των Mac1 ρυθμιζόμενων γονιδίων. Επεκτείνεται και κατά μήκος της κωδικής περιοχής του γονιδίου CTR1, ακολουθώντας μάλιστα το ιδιαίτερο πρότυπο κατανομής της RNA πολυμεράσης II. Αποδείξαμε ότι αποκλειστικά υπεύθυνα για την στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή είναι στοιχεία του συμπλόκου έναρξης της μεταγραφής αφού πετύχαμε την στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή του γονιδίου ACT1 (όπου φυσιολογικά δεν στρατολογείται) συγχωνεύοντας στο 5΄ακρο του στο γονιδίωμα τον υποκινητή του γονιδίου CTR1. Μάλιστα δείξαμε ότι η στρατολόγηση της στην κωδική περιοχή εν μέρει οφείλεται στην πρωτεΐνη Hir1 (τσαπερόνη ιστονών) η οποία εμπλέκεται τόσο στην έναρξη όσο και στην επιμήκυνση της μεταγραφής του CTR1 (βλέπε παρακάτω). Αντίθετα, η διμεθυλίωση της ιστόνης Η3 στην Κ79 γνωστή για την αναγνώρισή της από την Rad9 σε περίπτωση βλάβης στο DNA (Huyen et al., 2004), δεν φαίνεται να εμπλέκεται στην στρατολόγηση της Rad9 στην κωδική περιοχή του CTR1. Ταυτόχρονα βρήκαμε την Rad9 να αλληλεπιδρά φυσικά και γενετικά και με παράγοντες που εμπλέκονται στην έναρξη και επιμήκυνση της μεταγραφής του CTR1 (όπως η Hir1) και παράλληλα να στρατολογεί στην κωδική περιοχή του CTR1 και άλλους παράγοντες που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA (για παράδειγμα την κινάση Rad53). Τα δεδομένα μας, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι το CTR1 (και η «γειτονία» του FRE1) ανήκει σε μια ομάδα γονιδίων που χαρακτηρίζονται ως hotspot για μειωτικό ανασυνδυασμό (ο οποίος ξεκινά με σπάσιμο της δίκλωνης αλυσίδας του DNA), μας οδηγούν στο συμπέρασμα πως η Rad9 έχει διαμεσολαβητικό ρόλο μεταξύ στοιχείων του συμπλόκου της μεταγραφικής μηχανής και του συμπλόκου επιδιόρθωσης του DNA κάτω από φυσιολογικές, χωρίς προκλήσεις συνθήκες. Συνεπώς στοιχεία της μεταγραφικής μηχανής (κυρίως χρωματινικοί αναδιαμορφωτές) είναι παρόντα στην περιοχή έναρξης του μειωτικού ανασυνδυασμού και διαθέσιμα να χρησιμοποιηθούν από τον επιδιορθωτικό μηχανισμό του DNA υπό την επίβλεψη του Rad9.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
In Saccharomyces cerevisiae, Mac1 is a copper-regulated. Mac1 recognizes and binds to specific DNA sequences and activates genes involved in copper uptake (CTR1, CTR3, FRE1, FRE7). Previous evidence suggested that, in addition to copper (copper ions negatively regulate Mac1), protein interactions could modulate Mac1 function (Voutsina et al., 2001). In order to identify such proteins, a genomic expression library was screened using the two yeast hybrid technology (Bilsland et al., 2004; Voutsina et al., 2005). Among the potentially Mac1-interacting proteins, the nuclear phosphoprotein Rad9 and the histone chaperone Hir1were identified. Rad9 is a prototype DNA-damage checkpoint protein required for the DNA checkpoint pathway when DNA damage occurs (double strand break) by X-ray irradiation through out the cell cycle. In this study, we present evidence indicating a new direct role of Rad9 in RNA polymerase II-dependent transcription that is independent of cell cycle checkpoint. We found ...
In Saccharomyces cerevisiae, Mac1 is a copper-regulated. Mac1 recognizes and binds to specific DNA sequences and activates genes involved in copper uptake (CTR1, CTR3, FRE1, FRE7). Previous evidence suggested that, in addition to copper (copper ions negatively regulate Mac1), protein interactions could modulate Mac1 function (Voutsina et al., 2001). In order to identify such proteins, a genomic expression library was screened using the two yeast hybrid technology (Bilsland et al., 2004; Voutsina et al., 2005). Among the potentially Mac1-interacting proteins, the nuclear phosphoprotein Rad9 and the histone chaperone Hir1were identified. Rad9 is a prototype DNA-damage checkpoint protein required for the DNA checkpoint pathway when DNA damage occurs (double strand break) by X-ray irradiation through out the cell cycle. In this study, we present evidence indicating a new direct role of Rad9 in RNA polymerase II-dependent transcription that is independent of cell cycle checkpoint. We found Rad9 to associate directly with the copper-regulated transcriptional activator Mac1 and exert a negative effect on both its DNA binding and transactivation functions. We also found Rad9 to be recruited on Mac1-regulated genes in a Mac1- dependent manner. It was not only associated with CTR1 promoter but also along the CTR1 protein coding region. This Rad9 localization, coincided with transcriptional induction, correlated with the characteristic quantitative association pattern of RNA polymerase II and we also found that components of the Mac1-dependent transcriptional initiation complex were exclusively responsible for Rad9 localization in the coding region of CTR1 since we were able to transfer Rad9 in the coding region of ACT1 (were Rad9 is not normally localized) artificially fused downstream to the CTR1 promoter in the genome. We also found that Rad9 localization in the coding region was partly dependent on the Hir1 histone chaperone which is involved in transcription initiation and elongation of CTR1 (see below). On the contrary, histone H3 dimethylation of K79 known to be recognized by Rad9 under DNA damage conditions (Huyen et al., 2004) was irrelevant to Rad9 localization in the CTR1 coding region. We also identified new genetic and physical associations of Rad9 with elongating factors (e.g. Hir1), Mac1 interacting proteins and Rad9 dependent localization of DNA damage effectors on CTR1 gene (e.g. Rad53 kinase). Our data, in combination with the fact that CTR1 (and FRE1 «neighborhood») belongs to a group of genes that are characterized as hotspots for meiotic recombination (which is initiated by the formation of DSB) point to a new role for Rad9 mediating a crosstalk between transcription and DNA repair under physiological unchallenged conditions. When meiotic recombination begins, components of the transcriptional machinery (mainly chromatin remodelers) are already present ready to be used by the DNA repair machinery under the surveillance of Rad9.
περισσότερα