Αξιολόγηση της επίδρασης των μονωτών χρωματίνης (Chromatin insulators) στην έκφραση γονιδίων ενσωματωμένων σε ρετροϊικούς φορείς (retroviral vectors)

Abstract

Πρωταρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου των μονωτών χρωματίνης (chromatin insulators), και συγκεκριμένα του μονωτή χρωματίνης cHS4 (chicken Hypersensitive site 4), στην προστασία της έκφρασης του μεταφερόμενου γονιδίου μέσω ρετροιικών φορέων, από τις αρνητικές επιδράσεις του χρωματινικού περιβάλλοντος γύρω από τη θέση ενσωμάτωσης των φορέων. Είναι γνωστό ότι όταν γονίδια μετακινούνται από το φυσικό τους περιβάλλον, όπως στα διαγονιδιακά ζώα ή σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας, το νέο χρωμοσωμικό περιβάλλον έχει καθοριστική επίδραση και συχνά τα επίπεδα έκφρασης στη νέα θέση δεν έχουν καμμία ομοιότητα με αυτά της φυσικής τους θέσης. Αυτή η ανομοιογένεια στην έκφραση προκύπτει συνήθως λόγω γειτνίασης με έναν ενδογενή ενισχυτή ή αποσιωπητή ή αντανακλά την τοποθέτηση του γονιδίου αναφοράς κοντά σε περιοχή ανενεργού χρωματίνης. Τέτοιες επιδράσεις του χρωματινικού περιβάλλοντος μπορεί να είναι καταστροφικές για επιτυχείς εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Στα θηλαστικά η υπερευαίσθητη στην DNAse I περιοχή 4 από τον β γονιδιακό τόπο της όρνιθας (cHS4, chicken hypersensitive site 4), είναι η μόνη με αποδεδειγμένη δράση κλασσικού μονωτή χρωματίνης. Η δυνατότητα, ωστόσο, του cHS4 να δρα ως μονωτής χρωματίνης μετά από ενσωμάτωσή του σε ρετροιικούς φορείς και να προστατεύει την έκφραση του μεταφερόμενου γονιδίου από τα φαινόμενα θέσεως, δεν είχε μελετηθεί. Απώτερος στόχος της μελέτης, ήταν η κατασκευή ενός μονωμένου θεραπευτικού φορέα σφαιρίνης με προοπτική κλινικής χρήσης για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Η εργασία αυτή κατέδειξε για πρώτη φορά, ότι η ενσωμάτωση του τμήματος cHS4 σε κατασκευές ρετροιικών φορέων, μπορεί να εξασφαλίσει μακροχρόνια διατήρηση της έκφρασης γονιδίων αναφοράς (neo και GFP) σε μοντέλο διαμόλυνσης-μεταμόσχευσης ποντικών (DW Emery, E.Yannaki, J.Tubb and G.Stamatoyannopoulos. A chromatin insulator protects retrovirus vectors from chromosomal position effects. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(16):9150- 9155). Κατά συνέπεια, ο μη μονωμένος φορέας MGPN2 εμφάνισε σημαντική πτώση της GFP έκφρασης στα λευκά αιμοσφαίρια 2 μήνες μετά τη μεταμόσχευση με ένα εξαιρετικά μικρό κλάσμα αποικών της μυελικής σειράς να εκφράζουν το neo γονίδιο, ενώ αντίθετα, η μόνωση του φορέα με το τμήμα cHS4 βελτίωσε σημαντικά το ποσοστό των λευκών που εξέφραζαν την LTR → GFP κασέτα καθώς και το κλάσμα των προγονικών κυττάρων που εξέφραζαν την Pgk → neo κασέτα μακροπρόθεσμα. Παρόμοια προστασία της έκφρασης του μεταφερόμενου γονιδίου δείχθηκε και με θεραπευτικό γονίδιο (γ-σφαιρίνη) στους εξαιρετικά ευαίσθητους στις επιδράσεις των φαινομένων θέσεως φορείς σφαιρινών σε μοντέλο διαμόλυνσης-μεταμόσχευσης ποντικών (DW Emery, E. Yannaki, J. Tubb, T. Nishino, Q. Li, G.Stamatoyannopoulos. Development of virus vectors for gene therapy of β chain hemoglobinopathies: flanking with a chromatin insulator reduses γ-globin gene silencing in vivo. Blood 2002; 100(6):2012-2019). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η πλαισίωση του φορέα της γ-σφαιρίνης με τον cHS4 μονωτή χρωματίνης αύξησε την πιθανότητα έκφρασης της γ-κασσέτας σχεδόν 10 φορές (από 5.1%±7.2% σε 48.9%±19.9%) για τα κύτταρα που περιείχαν τον προιό και το ποσοστό των ερυθρών που εξέφραζαν τη γ-σφαιρίνη συνέχιζε να αυξάνει με την πάροδο του χρόνου. Αντίθετα, στον μη μονωμένο φορέα το γονίδιο της γ- σφαιρίνης ήταν αποσιωπημένο στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων. Πράγματι, η μόνωση που παρατηρήθηκε ήταν σημαντική και εξασφάλισε ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης γ-σφαιρίνης που θα μπορούσε δυνητικά να αποδώσει ένα θεραπευτικό όφελος σε ασθενείς με μεσογειακή αναιμία ή δρεπανοκυτταρική νόσο καθώς αυξημένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης HbF μπορούν να μετριάσουν τη βαρύτητα των συνδρόμων αυτών και να αποδεσμεύσουν τους πάσχοντες από την ανάγκη μεταγγίσεων. Η επιτευχθείσα μόνωση ωστόσο, αν και σημαντική παραμένει ατελής, καθώς ένα ποσοστό του ενσωματωμένου προιού είναι ‘σιωπηλό’ και η παρατηρούμενη έκφραση της γ-σφαιρίνης είναι ανομοιογενής. Ο ενσωματωμένος προιός δηλαδή, εξακολουθεί να διατηρεί ακόμη κάποια ευαισθησία - αν και σαφώς ελαττωμένη - στις επιδράσεις της περιβάλλουσας χρωματίνης. Δείξαμε επίσης ότι η μόνωση δεν είναι ολοκληρωτική γιατί υπόκειται σε ισχυρούς τοπογραφικούς περιορισμούς ανάλογα με την απόσταση του μονωτή από τους αντίστοιχους υποκινητές (E. Yannaki, J. Tubb, M. Aker, G. Stamatoyannopoulos, DW Emery. Topological constraints governing the use of the chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrovirus vectors. Molecular therapy 2002; Vol(5):589-598). Συγκεκριμένα, η μονωτική δραστηριότητα ελλαττώνεται όταν το πυρηνικό (core) στοιχείο του cHS4 τοποθετείται αμέσως δίπλα στον ενισχυτή-υποκινητή στόχο. Ειδικότερα, η τοποθέτηση του τμήματος cHS4 στην αρχή της περιοχής U3 από την 3' LTR μπορεί να μπλοκάρει την αλληλεπίδραση ανάμεσα στον 3' LTR ενισχυτή και σε εσωτερικές κασσέτες έκφρασης που μπορεί να βασίζονται σε αυτή την αλληλεπίδραση για έκφραση υψηλού επιπέδου. Επίσης, η μόνωση είναι ατελής στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα είτε γιατί αυξάνει η βαρύτητα των φαινομένων θέσεως ή γιατί συμβαίνει αυτόνομη αποσιώπηση των υποκινητών. Παρά το γεγονός ότι η μόνωση που προσδίδει η πλαισίωση των ρετροιικών φορέων με τον μονωτή χρωματίνης cHS4 δεν είναι πλήρης, η δυνατότητα βελτίωσης της εκτελεστικής ικανότητας των ρετροιικών φορέων που προκύπτει από την ενσωμάτωση των μονωτών χρωματίνης σε κατασκευές θεραπευτικών φορέων είναι σημαντική. Έτσι, μελέτες που ακολούθησαν από άλλους ερευνητές και έκαναν χρήση θεραπευτικών φορέων σφαιρίνης, υιοθέτησαν την ενσωμάτωση του συγκεκριμένου μονωτή στην ιική κατασκευή και έδειξαν πλήρες θεραπευτικό όφελος (Puthenveetil, G.,Blood 2004). Τα τελευταία χρόνια προτείνεται επίσης η ενσωμάτωση μονωτών χρωματίνης σε κατασκευές ιικών φορέων, και ως πρόσθετο στοιχείο ασφάλειας, καθώς η ιδιότητά τους να δρουν ως διακόπτες ενισχυτών όταν τοποθετούνται μεταξύ υποκινητή-ενισχυτή μπορεί θεωρητικά να μπλοκάρει την ενεργοποίηση ογκογονιδίων κατά την (τυχαία) ενσωμάτωση του προιού στο γονιδίωμα, ελαχιστοποιώντας έτσι τον κίνδυνο της εισχωρητικής μεταλλαξιογένεσης-ογκογένεσης. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι η πρώτη κλινική μελέτη γονιδιακής θεραπείας για τη θαλασσαιμία, που ξεκίνησε στη Γαλλία τον Σεπτέμβριο του 2006, κάνει χρήση ενός λεντιικού φορέα β- σφαιρίνης που είναι μονωμένος με το τμήμα cHS4. Η εργασία αυτή ολοκληρώθηκε πειραματικά το 2002. Ένα μέρος της εκπονήθηκε στο Medical Genetics Department του Πανεπιστημίου της Washington και το υπόλοιπο στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Αιματολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Γ. Παπανικολάου. Η εργασία αυτή αποτέλεσε την αφετηρία για την έναρξη ενός μακρόπνοου προγράμματος Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας στο Νοσοκομείο Παπανικολάου σε συνεργασία με το Πανεπιστήμιο της Washington και τον καθηγητή George Stamatoyannopoulos. Στα χρόνια που ακολούθησαν, δημιουργήθηκε στο Νοσοκομείο Παπανικολάου, υπαγόμενη στο πλαίσιο λειτουργίας της Αιματολογικής Κλινικής- Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών, η πρώτη Μονάδα Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας στην Ελλάδα, σε συμμόρφωση με τα GMP (Good Manufacturing Practice) πρότυπα και παράλληλα διαμορφώθηκε και εγκρίθηκε από τις θεσμικές αρχές Ελλάδας και Αμερικής ένα κλινικό πρωτόκολλο γονιδιακής θεραπείας σε ασθενείς με μεσογειακή αναιμία που πραγματοποιείται στη Θεσσαλονίκη και ξεκίνησε τον Φεβρουάριο του 2007.