Εξατομίκευση της θεραπείας με υδροξυουρία ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες: μοριακή ανάλυση και αξιολόγηση φαρμακογονιδιωματικών δεικτών

Abstract

Patients with β-hemoglobinopathies exhibit a variety of phenotypes, due to mutations located in the β-gene encoding the β-globin chain of HbA and, due to genetic variations located in modifying genes encoding important transcription factors, that act in trans to the human β-globin cluster and regulate its expression. Several studies have shown that elevated levels of fetal hemoglobin improve the clinical symptoms in adult patients with β-hemoglobinopathies.In the present study, mutations in the β-globin gene as well as genetic variants located in FLT1, ARG2, NOS2A, KLF10, MAP3K5, PDE7B, ASS1, NOS1 and TOX genes were determined. These modifying genes act in trans and seem to be involved in regulating the expression of γ-globin genes in adult patients with β-hemoglobinopathies. We recruited and genotyped 38 transfusion-dependent β-thalassemia patients (TDT), 7 non-transfusion-dependent β-thalassemia patients (NTDT), 53 healthy individuals as well as 42 compound heterozygotes with sickle cell disease/β-thalassemia of Hellenic origin. The latter group of patients was treated with hydroxyurea in order to increase their HbF levels and, as a result, improve their clinical phenotype. However, not all patients respond to this medication. The aim of the present study was to highlight genetic variants in the above-mentioned modifying genes that could be used as potential (pharmaco)genomic biomarkers. These biomarkers are associated with β-thalassemia patients’ ability to produce high or low HbF levels, thus, improving or not their clinical phenotype, as well as the patients’ response to HU treatment. Furthermore, we aimed to validate previous studies conducted in our laboratory (LPIT), as far as the above-mentioned biomarkers are concerned, including their data to ours, thus increasing our statistical sample and the validity of our results.β-globin gene mutations were determined by PCR analysis and Sanger sequencing. In order to determine the genetic variants in the above-mentioned modifying genes, PCR analysis was carried out followed either by Sanger sequencing or by RFLP or Heteroduplex Analysis. Furthermore, some cases were analyzed by allele-specific PCR.Our study revealed a statistically significant correlation between STR-5’-GCGCG-3’ of MAP3K5 gene, rs944725 of NOS2A gene and rs10483801 of ARG2 gene with hydroxyurea response in β-thalassemia/sickle cell disease compound heterozygotes. Furthermore, our study revealed a statistically significant correlation between rs2182008 of FLT1 gene, rs3191333 of KLF10 gene and rs10483801 of ARG2 gene with β-thalassemia intermedia phenotype-NTDT patients, who can produce elevated HbF levels without carrying HPFH syndromes, thus improving their clinical phenotype.

Ο κλινικός φαινότυπος των ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες ποικίλλει, γεγονός που οφείλεται αφενός στις μεταλλάξεις που εντοπίζονται στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη β-αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης HbΑ και αφετέρου σε τροποποιητικά γονίδια που κωδικοποιούν σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες που δρούν in trans ως προς το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση των γονιδίων του. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης μπορεί να βελτιώσει την κλινική εικόνα των ενήλικων ασθενών με β-αιμοσφαιρινοπάθειες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκαν οι μεταλλάξεις και οι γενετικές παραλλαγές, αφ’ενός στο γονίδιο της β-σφαιρίνης και αφ’ετέρου στα τροποποιητικά γονίδια FLT1, ARG2, NOS2A, KLF10, MAP3K5, PDE7B, ASS1, NOS1 και TOX που δρουν in trans και εμπλέκονται και στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων της γ-σφαιρίνης σε ενήλικες ασθενείς με β-αιμοσφαιρινοπάθειες. Μελετήθηκαν ενήλικες ασθενείς ελληνικής καταγωγής και συγκεκριμένα, 38 ασθενείς με εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, 7 ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, 42 ασθενείς με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία και 53 υγιή άτομα, ως μάρτυρες. Στους μικροδρεπανοκυτταρικούς ασθενείς χορηγείται υδροξυουρία προκειμένου να αυξήσουν τα επίπεδα της εμβρυϊκής τους αιμοσφαιρίνης και κατά συνέπεια να βελτιώσουν τον κλινικό τους φαινότυπο. Παρ’ όλα αυτά δεν ανταποκρίνονται όλοι οι ασθενείς σε αυτή τη φαρμακευτική αγωγή. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη (φαρμακο)γονιδιωματικών δεικτών. Η παρουσία αυτών των δεικτών σχετίζεται με τη δυνατότητα α) των ασθενών με β-θαλασσαιμία να παράγουν υψηλά επίπεδα HbF, απουσία του HPFH συνδρόμου, εμφανίζοντας φαινότυπο μη εξαρτώμενης μεταγγίσεων β-θαλασσαιμίας–ενδιάμεση β-θαλασσαιμία ή ασθενών που δεν έχουν αυτή τη δυνατότητα εμφανίζοντας κλινικό φαινότυπο βαριάς β-θαλασσαιμίας εξαρτώμενη από μεταγγίσεις και β) των μικροδρεπανοκυτταρικών ασθενών να ανταποκρίνονται στη θεραπευτική αγωγή με υδροξυουρία. Απώτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν και η επιβεβαίωση των συγκεκριμένων γενετικών παραλλαγών στα προαναφερθέντα τροποποιητικά γονίδια ως φαρμακογονιδιωματικών δεικτών, συμπεριλαμβάνοντας και αποτελέσματα προηγούμενων μελετών του εργαστηρίου Ε.Φ.Ε.Θ, προκειμένου να αυξηθεί το στατιστικό δείγμα και η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων. Ο προσδιορισμός των μεταλλάξεων του γονιδίου της β-σφαιρίνης έγινε με ενίσχυση του γονιδίου με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) και ακολούθως αλληλούχηση κατά Sanger. Οι γενετικές παραλλαγές προσδιορίστηκαν είτε με αλληλούχηση κατά Sanger, είτε με κατάτμηση με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού ή με εφαρμογή της μεθόδου ανάλυσης των ετεροδιμερών (Heteroduplex Analysis, HDA), αφού είχε προηγηθεί ενίσχυση με PCR των συγκεκριμένων τμημάτων των τροποποιητικών γονιδίων που φέρουν τις συγκεκριμένες γενετικές παραλλαγές, είτε με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ειδικής για το αλληλόμορφο (Allele Specific PCR).Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ανέδειξαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μικρής επαναλαμβανόμενης εν σειρά αλληλουχίας - STR-5’-GCGCG-3’ στον υποκινητή του MAP3K5 γονιδίου με την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία των ασθενών με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία. Επίσης, σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs944725 στο NOS2A γονίδιο και rs10483801 στο ARG2 γονίδιο, με την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία των ασθενών με μικροδρεπανοκυτταρική αναιμία. Επιπλέον, βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών rs2182008 στο FLT1 γονίδιο, του rs3191333 στο KLF10 γονίδιο και του rs10483801 στο ARG2 γονίδιο με το φαινότυπο ενδιάμεσης β-θαλασσαιμίας που εμφανίζουν οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, οι οποίοι έχουν την ικανότητα να παράγουν αυξημένα επίπεδα εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, απουσία του HPFH συνδρόμου, βελτιώνοντας τον κλινικό τους φαινότυπο.