Βιοχημικές επιδράσεις επιλεγμένων φυτοφαρμάκων σε μυς και επιμύς

Abstract

The research undertaken in the framework of this Ph.D. thesis aimed mainly at elucidating the biochemical mechanisms involved in the neurotoxic actions of organophosphate and carbamate pesticides. Exposure to these compounds constitutes one of the main causes of poisoning in non-target animal species. The organophosphate chlorpyrifos (CPF) and the carbamate carbaryl (CB) were selected for the study, since these substances represent two of the most extensively used pesticides worldwide. The neurotoxicity of the CB and CPF was assessed in terms of the effects that these compounds exert on both axonal- and synaptic-related events. Accordingly, this research work focused on the effects of CB and CPF on axonal development and neurotransmission. The investigation of the effects of CB and CPF on the process of axon formation involved the use of differentiating mouse neuroblastoma N2a cells in culture. The test compounds were initially assessed in terms of their ability to inhibit the development of axons from N2a cells. CB and CPF were subsequently evaluated in relation to their action on relevant biochemical parameters. Such parameters included: a. the neurofilament heavy chain (neurofilament high molecular weight protein subunit, NF-H) levels, b. the α-tubulin levels, c. the growth associated axonal protein-43 (GAP-43) levels, and d. the activity of the enzyme neuropathy target esterase (NTE). Determination of NF-H, α-tubulin and GAP-43 levels was attained by Western blotting analysis of lysed cell extracts, whereas NTE activity was measured spectrophotometrically. Preliminary experiments, employing the spectrophotometric method of MTT reduction, showed that a final concentration of 3 μΜ for each pesticide has no effect on the viability of N2a cells and this concentration was, therefore, subsequently adopted throughout the course of the study. The results showed that both CB and CPF are capable of reducing significantly the number of the axons extended by differentiating N2a cells after 4 and 8 hours. Western blot analysis indicated that CPF causes a reduction in NF-H levels after 8 hours, whereas CB exerts no effect. α-tubulin levels were shown to be unaffected by either pesticide exposure. On the other hand, both test compounds induce an increase in the expression of GAP-43 after 4 hours. However, GAP-43 levels were found to decrease after 8 hours exposure to CPF. Finally, CPF was shown to inhibit significantly NTE activity after 4 and 8 hours, whereas CB effects NTE inhibition only after 8 hours.

Η έρευνα που διενεργήθηκε στα πλαίσια της διδακτορικής αυτής διατριβής είχε ως πρωταρχικό στόχο τη διαλεύκανση των βιοχημικών φαινομένων και μηχανισμών που ενέχονται στην τοξική δράση που ασκούν επιλεγμένα οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά παρασιτοκτόνα στο νευρικό σύστημα των ζώων. Τα παρασιτοκτόνα αυτά συνιστούν μία από τις κυριότερες αιτίες δηλητηριάσεων στα ζώα. Για την πραγματοποίηση της έρευνας επιλέχθηκαν το οργανοφωσφορικό chlorpyrifos (CPF) και το καρβαμιδικό carbaryl (CB), δεδομένου ότι οι ουσίες αυτές αποτελούν δύο από τα συχνότερα χρησιμοποιούμενα παρασιτοκτόνα παγκοσμίως. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι νευροτοξικές δράσεις του CB και του CPF τόσο στο επίπεδο του νευράξονα όσο και σε αυτό της σύναψης. Στα πλαίσια αυτά, εξετάστηκε η επίδραση των παραπάνω ουσιών σε βιοχημικές παραμέτρους που συνδέονται αφενός με τη διαδικασία της ανάπτυξης των αξόνων και αφετέρου με τη διαδικασία της νευροδιαβίβασης. Η μελέτη της επίδρασης των δύο υπό εξέταση ουσιών στη διαδικασία σχηματισμού των αξόνων έγινε με τη χρησιμοποίηση καλλιεργειών υπό διαφοροποίηση νευροβλαστωματικών κυττάρων Ν2a από μυ. Αρχικά, προσδιορίστηκε ποσοτικά, με τη βοήθεια μικροσκοπίου, η ικανότητα του CB και του CPF να προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των αξόνων από τα κύτταρα Ν2a και ακολούθησε η εξέταση της επίδρασης των δύο παρασιτοκτόνων σε σχετικές βιοχημικές παραμέτρους. Οι παράμετροι αυτές ήταν: α. τα επίπεδα της βαριάς αλύσου των νευρικών νηματίων του κυτταρικού σκελετού (πρωτεΐνη NF-H), β. τα επίπεδα της α-τουμπουλίνης των μικροσωληνίσκων του κυτταρικού σκελετού, γ. τα επίπεδα της πρωτεΐνης ανάπτυξης του νευράξονα-43 (GAP-43) και δ. η δραστικότητα του ενζύμου «εστεράση που αποτελεί στόχο νευροπάθειας» (ΝΤΕ). Ο προσδιορισμός των επιπέδων των πρωτεϊνών NF-H, α-τουμπουλίνης και GAP-43 έγινε με ανοσοχημικές τεχνικές ανάλυσης πρωτεϊνών κατά Western και τη χρήση κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων, ενώ ο προσδιορισμός της δραστικότητας της ΝΤΕ έγινε με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Σε προκαταρκτικά πειράματα δείχθηκε, με τη χρήση της φασματοφωτομετρικής μεθόδου της αναγωγής της ουσίας ΜΤΤ, ότι η συγκέντρωση των δύο παρασιτοκτόνων που χρησιμοποιήθηκε κατά τον κύριο πειραματισμό (3 μΜ) δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων κάτω από τις συνθήκες επώασης που εφαρμόστηκαν.